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DOF: 22/12/2015
NORMA Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2015, Productos y servicios

NORMA Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2015, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias.

Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.

MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en los artículos 39, de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4, de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3o., fracción XXII, 13, Apartado A, fracciones I, II y IX, 116, 118, fracciones II, IV y VII, 119, fracción II, 120, 122, 194, 205 y 207, de la Ley General de Salud; 40, fracciones III, VII y XI, 41, 43, 44 y 47, fracción IV, de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 y 31, del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 4o., 15, 20, 25, 30, 101, 102 y 103, del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 2o., fracciones I, inciso a), 12, 209, 210, 211, 213, 215, 216, 217, 220, 221, 222, 223, 224 y 1336, del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; 36, del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud y 3o., fracción I, incisos, b), e), i) y k) y 10, fracciones IV y VIII, del Reglamento de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios, y
CONSIDERANDO
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46, fracción I, de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, el 18 de diciembre de 2013, el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, aprobó el anteproyecto de la presente Norma;
Que con fecha 12 de febrero de 2014, en cumplimiento a lo previsto en el artículo 47, fracción I, de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, se publicó en el Diario Oficial de la Federación, el proyecto de la presente Norma, a efecto de que dentro de los 60 días naturales siguientes al de su publicación, los interesados presentaran sus comentarios al Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario;
Que con fecha previa, fueron publicadas en el Diario Oficial de la Federación, las respuestas a los comentarios recibidos por el mencionado Comité, en términos del artículo 47, fracción III, de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, y
Que en atención a las anteriores consideraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, he tenido a bien expedir y ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación, de la siguiente
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-201-SSA1-2015, PRODUCTOS Y SERVICIOS. AGUA Y HIELO PARA
CONSUMO HUMANO, ENVASADOS Y A GRANEL. ESPECIFICACIONES SANITARIAS
PREFACIO
En la elaboración de esta Norma Oficial Mexicana participaron las unidades administrativas, instituciones y organismos siguientes:
SECRETARÍA DE SALUD.
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.
ANALYSIS AND RESEARCH LAB, S.A. DE C.V.
ASOCIACIÓN NACIONAL DE PRODUCTORES DE REFRESCOS Y AGUAS CARBONATADAS, A.C.
ASOCIACIÓN NACIONAL DE PRODUCTORES Y DISTRIBUIDORES DE AGUA PURIFICADA, A.C.
BONAFONT S.A. DE C.V.
COCA COLA DE MÉXICO.
CORPORATIVO DE SERVICIOS EN AGUA Y AMBIENTE, S.A. DE C.V.
GRUPO CENCON.
GRUPO EMBOTELLADORAS UNIDAS, S.A.B. C.V.
GRUPO PEÑAFIEL S.A. DE C.V.
LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RIESGOS DEL D.F.
LABORATORIO DE SERVICIOS AMBIENTALES.
 
NESTLÉ MÉXICO S.A. DE C.V.
SERVICIOS PROFESIONALES QUÍMICOS BIOLÓGICOS S.A. DE C.V.
SERVICIOS DE AGUA Y DRENAJE DE MONTERREY S.A. DE C.V.
TECNOLOGÍA AMBIENTAL INTEGRAL S.A. DE C.V.
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
Facultad de Química.
ÍNDICE
1.    Objetivo y campo de aplicación.
2.    Referencias.
3.    Definiciones.
4.    Símbolos y abreviaturas.
5.    Disposiciones sanitarias.
6.    Control Sanitario del agua y hielo para consumo humano.
7.    Procedimiento de evaluación de la conformidad.
8.    Etiquetado.
9.    Concordancia con normas internacionales.
10.   Bibliografía.
11.   Observancia de la Norma.
12.   Vigencia.
       Apéndice normativo A. Métodos de pruebas microbiológicas y fisicoquímicas.
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1 Esta Norma establece las características y especificaciones sanitarias que deben cumplir el agua y el hielo para consumo humano que se comercialice preenvasado o a granel y los establecimientos que se dediquen al proceso o importación de dichos productos.
1.2 Esta Norma es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que se dedican al proceso o importación de agua y hielo para consumo humano que se comercialicen preenvasados o a granel.
2. Referencias
Para la correcta aplicación de esta Norma, se sugiere consultar las siguientes Normas Oficiales Mexicanas o las que las sustituyan:
2.1 Norma Oficial Mexicana NOM-008-SCFI-2002, Sistema General de Unidades de Medida.
2.2 Norma Oficial Mexicana NOM-026-STPS-2008, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías.
2.3 Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010, Especificaciones generales de etiquetado para alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados-Información comercial y sanitaria.
2.4 Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.
2.5 Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009, Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios.
3. Definiciones
Para fines de esta Norma se entiende por:
3.1 A granel: al producto que debe pesarse, medirse o contarse en presencia del consumidor por no encontrarse preenvasado al momento de su venta.
3.2 Agua para consumo humano: a toda aquella cuya ingestión no cause efectos nocivos a la salud. Se considera que no causa efectos nocivos a la salud, cuando se encuentra libre de gérmenes patógenos y de sustancias tóxicas, y cumpla, además con los requisitos que se señalan en la presente Norma.
3.3 Agua mineral natural: a la que se caracteriza por un contenido determinado de sales minerales y sus proporciones relativas. Se obtiene directamente de manantiales o fuentes perforadas procedentes de estratos acuíferos. En los perímetros protegidos de estos estratos deberán adoptarse las medidas pertinentes para evitar que la calidad química o física del agua sufra algún tipo de contaminación, esto es, que mantenga su composición y calidad constantes. Se debe envasar cerca del punto de surgencia de la fuente, en condiciones que garanticen la pureza microbiológica y la composición química original en sus constituyentes esenciales y no se debe someter a otros tratamientos que no estén permitidos por esta Norma y que puede estar o no carbonatada.
3.4 Agua mineralizada: al agua purificada que ha sido adicionada de sales, y que puede estar o no carbonatada.
3.5 Aislado: a la separación física de un área de otras por medio de material sanitario, resistente y permanente.
3.6 Área de llenado: a la zona donde se envasa y tapa el producto.
3.7 Área de producción: a la zona del establecimiento donde se realizan las operaciones para procesar agua y hielo para consumo humano.
3.8 Carbono orgánico: a todo aquel carbono enlazado covalentemente a moléculas orgánicas.
3.9 Cisterna: al depósito que sirve para almacenar el producto o materia prima en establecimientos o en transporte.
3.10 Carbono orgánico purgable: al grupo de parámetros analíticos que comprende a los compuestos orgánicos volátiles no halogenados.
3.11 Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos: al grupo de parámetros analíticos que comprende a los halogenados no volátiles como las dioxinas y furanos, herbicidas clorados, bifenilos policlorados, plaguicidas clorados y semivolátiles clorados.
3.12 Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables: al grupo de parámetros analíticos que comprende a los halogenados volátiles como los halometanos, hidrocarburos clorados de bajo peso molecular y volátiles clorados.
3.13 Compuestos orgánicos no halogenados: al grupo de parámetros analíticos que comprende a los carbamatos, hidrocarburos poliaromáticos, plaguicidas fosforados, compuestos orgánicos semivolátiles no clorados, endotal, glifosato y plaguicidas derivados de la urea.
3.14 Consumidor: a la persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final los productos regulados en esta norma
3.15 Desinfección: a la reducción del número de microorganismos presentes, por medio de agentes químicos y/o métodos físicos, a un nivel que no comprometa la inocuidad o la aptitud del alimento, bebida o suplemento alimenticio.
3.16 Establecimientos: a los locales y sus instalaciones, dependencias y anexos, estén cubiertos o descubiertos, sean fijos o móviles, en los que se desarrolla el proceso de los productos, actividades y servicios a los que se refiere esta Norma.
3.17 Etiqueta: a cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva o gráfica, escrita, impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepuesta o fijada al envase del producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del producto, al embalaje.
3.18 Envase: a cualquier recipiente, o envoltura en el cual está contenido el producto preenvasado para su venta al consumidor.
3.19 Evaluación de la conformidad: a la determinación del grado de cumplimiento con las normas oficiales mexicanas o la conformidad con las normas mexicanas, las normas internacionales u otras especificaciones, prescripciones o características. Comprende, entre otros, los procedimientos de muestreo, prueba, calibración, certificación y verificación; la cual se encuentra en la Ley Federal de Metrología y Normalización.
 
3.20 Expendio: al área o establecimiento donde se exhiben o comercializan los productos objeto de esta Norma.
3.21 Fuente de abastecimiento: al lugar a partir del cual se obtiene el agua como materia prima, incluye pero no limita a pozos, manantiales, entre otros, sin considerar los sistemas de abastecimiento de agua potable.
3.22 Hielo para consumo humano: al producto obtenido por congelación del agua para consumo humano.
3.23 Inocuo: a lo que no hace o causa daño a la salud.
3.24 Límite máximo permisible: a la cantidad establecida de los parámetros que no se debe exceder en el producto terminado.
3.25 Limpieza: a la acción que tiene por objeto quitar la suciedad.
3.26 Lote: a la cantidad de un producto elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades homogéneas e identificadas con un código específico.
3.27 Máquina automática para la producción de agua o hielo: a la que cuenta con todo el equipo necesario para el tratamiento y expendio de agua o hielo para consumo humano a granel o envasado.
3.28 Materia extraña: a la sustancia, resto o desecho orgánico o no, que se presenta en el producto, sea por contaminación o por manejo no higiénico del mismo durante su elaboración, o comercialización, considerándose entre otros: excretas, pelos de cualquier especie, huesos e insectos.
3.29 Materia prima: a todas las sustancias que se emplean en la producción o elaboración y que forman parte del producto terminado.
3.30 Material sanitario: al que no cede sustancias tóxicas a los productos, que entran en contacto con él y es de fácil limpieza y desinfección.
3.31 Personal: a todo aquel individuo que interviene en cualquier etapa del proceso.
3.32 Proceso: al conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación, preparación, conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, almacenamiento y expendio o suministro al público de los productos.
3.33 Producto preenvasado: al producto que fuera del punto de venta es colocado en un envase de cualquier naturaleza, en ausencia del consumidor final, y la cantidad de producto contenido en él no puede ser alterada a menos que el envase sea abierto o modificado perceptiblemente.
3.34 Producto terminado: al producto que se ofrecerá al consumidor final, ya sea preenvasado o a granel.
3.35 Riesgo: a la probabilidad de que se desarrolle cualquier propiedad biológica, química o física que cause daño a la salud del consumidor.
3.36 Salmuera: a la solución saturada de cloruro de sodio y que puede contener aditivos.
3.37 Tratamiento: a la operación o serie de operaciones a la que es sometida el agua o el hielo durante su elaboración, con el propósito de eliminar o reducir su contaminación.
4. Símbolos y abreviaturas
4.1 Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entenderá por:
4.1.1 ACUERDO
Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias.
4.1.2 Sb
Antimonio.
4.1.3 As
Arsénico.
4.1.4 Bq/L
Bequerel por litro.
4.1.5 CO2
Bióxido de carbono.
4.1.6 B
Boro
4.1.7 Cd
Cadmio.
4.1.8 cm
Centímetro.
4.1.9 cm2
Centímetro cuadrado.
4.1.10 Co
Cobalto
4.1.11 AOX
Compuestos orgánicos halogenados absorbibles
4.1.12 Cu
Cobre.
4.1.13 DGN
Dirección General de Normas.
4.1.14 SPA
Establecimientos Salud por Agua.
4.1.15 h
Hora.
4.1.16 F-
Ión fluoruro.
4.1.17 Ley
Ley General de Salud.
4.1.18 L
Litro.
4.1.19 Hg
Mercurio.
4.1.20 P-A
Método de presencia ausencia.
4.1.21 µ
Microohm.
4.1.22 µg
Microgramo.
4.1.23 mL
Mililitro.
4.1.24 mg
Miligramo.
4.1.25 mg/L
Miligramo por litro.
4.1.26 mm
Milímetro.
4.1.27 µS/cm
MicroSiemens sobre centímetro.
4.1.28 No.
Número.
4.1.29 NMP
Número Más Probable.
4.1.30 %
Por ciento
4.1.31 Pt
Platino.
4.1.32 Pb
Plomo.
4.1.33 pH
Potencial de hidrógeno.
4.1.34 Reglamento
Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.
4.1.35 Se
Selenio.
4.1.36 UFC
Unidades Formadoras de Colonias.
4.1.37 UNT
Unidades Nefelométricas de Turbiedad.
 
5. Disposiciones sanitarias
Los establecimientos, además de cumplir con lo establecido en la Ley, el Reglamento y la Norma Oficial Mexicana citada en el punto 2.5, del capítulo de Referencias, de esta Norma, deben observar las disposiciones siguientes:
5.1 Agua.
5.1.1 Abastecimiento sanitario del agua. En caso de que la materia prima se obtenga directamente de una fuente de abastecimiento:
5.1.1.1 No deben construirse obras de captación en fuentes de abastecimiento cuyas cargas de contaminantes por su magnitud y peligrosidad pongan en riesgo la salud humana.
5.1.1.2 La fuente de abastecimiento y las obras de captación deben protegerse mediante separación física, con la altura o distancia suficiente que impida la deposición de desechos sólidos, líquidos o excretas y el paso de animales. Sólo se permitirá el acceso a personal autorizado.
5.1.1.3 Las tuberías, bombas y otros dispositivos que estén en contacto con el agua para consumo humano y que sean utilizados para la captación, deben ser de material sanitario.
5.1.2 Establecimientos.
5.1.2.1 Además de lo establecido en la Norma Oficial Mexicana citada en el punto 2.2, del capítulo de Referencias, de esta Norma, las tuberías que conduzcan agua en distintas etapas del proceso o fluidos diferentes de ésta, se deben identificar de acuerdo con el código propio de la empresa, que debe proporcionarse durante la verificación. Cualquier forma de identificación debe ser visible para el personal desde el inicio de las áreas del proceso.
5.1.2.2 El agua que se utilice para propósitos no relacionados con el producto, debe transportarse por tuberías diferentes, separadas, sin que haya alguna conexión ni sifonado de retroceso con las tuberías que transportan la de proceso y el agua lista para envasarse.
5.1.2.3 Las áreas de lavado y desinfección, llenado y de producción deberán cumplir con lo siguiente:
5.1.2.3.1 El área de llenado debe estar completamente aislada de las demás áreas, durante dicha operación, los accesos de recepción y salida del envase deben mantenerse cerrados o protegidos de manera que se evite la contaminación del producto.
5.1.2.3.2 Las boquillas de llenado, así como las válvulas y el maneral deben ser de material sanitario, limpiarse y desinfectarse al inicio de la operación.
5.1.2.3.3 Al paro de operaciones, el agua no debe permanecer en reposo en las tuberías. En caso de no haber un sistema que permita su desalojo, deben existir los procedimientos y sistemas para garantizar que el agua que permaneció en las tuberías regrese al principio del proceso donde se le someta a las operaciones necesarias que garanticen su inocuidad.
5.1.2.3.4 Para el caso de envases retornables, éstos deben ser sometidos a procesos de lavado y desinfección interna, lavado externo, así como enjuague. Después de estas operaciones no deben quedar residuos de las sustancias utilizadas.
5.1.2.4 Los establecimientos con venta directa a granel deberán contar con:
5.1.2.4.1 Además de los puntos señalados anteriormente, deberá contar con un área cerrada para el lavado de garrafones, quedan exentas las máquinas automáticas.
5.1.2.4.2 Un área de llenado ubicada fuera de tránsito vehicular, completamente aislada de las demás áreas y el inicio de operación de llenado no debe hacerse en tanto la puerta no esté cerrada. Preferentemente el dispositivo de llenado debe contar con un mecanismo de cierre automático que garantice lo anterior.
5.1.2.4.3 En caso que el establecimiento ponga envases vacíos o tapas a disposición del consumidor, éstos deberán ser nuevos, estar limpios, desinfectados y empacados.
5.1.2.4.4 Letreros visibles que señalen el riesgo que representa para la salud el llenado de envases sucios o que hayan contenido sustancias tóxicas y su manejo inadecuado. Las letras deben tener un tamaño de 5 cm de altura como mínimo y ser de colores contrastantes, refiriéndose a alguno de los siguientes temas: "TRANSPORTA TUS ENVASES Y GARRAFONES BIEN TAPADOS" o "NO UTILICES ENVASES QUE HAYAN CONTENIDO SUSTANCIAS TÓXICAS" o "LAVA Y DESINFECTA TU GARRAFÓN ANTES DE LLENARLO".
5.1.3 Transporte.
5.1.3.1 Cuando se lleven a cabo las operaciones de carga y descarga, tanto para el caso de materia prima como producto terminado, las conexiones entre la cisterna, válvulas y mangueras de distribución, así como el equipo en general del transporte de agua a granel, no debe presentar fugas. Durante el recorrido las bocas de las mangueras de las cisternas deben mantenerse protegidas con dispositivos de material sanitario, a fin de evitar su contaminación con el medio ambiente.
5.1.3.2 Las cisternas para el agua destinada al envasado no deberán ser utilizados para transportar otro tipo de agua.
5.1.3.3 El agua para consumo humano trasportada a granel no deberá ser comercializada directamente al consumidor final por este medio.
5.1.4 Condiciones sanitarias de los envases y tapas.
5.1.4.1 Las tapas deberán ser nuevas y de material inocuo. En caso de duda de la condición higiénica de envases o tapas deberán lavarse y desinfectarse con soluciones que no modifiquen, reaccionen o alteren sus características y evitando la contaminación por arrastre.
5.1.5 Especificaciones sanitarias del producto terminado.
5.1.5.1 Límites máximos permisibles del agua para consumo humano.
5.1.5.1.1 Organolépticas y físicas.
ESPECIFICACIÓN.
LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE.
Color.
15 (Pt/Co).
Turbiedad.
3,0 (UNT).
 
5.1.5.1.2 Microbiológicas.
ESPECIFICACIÓN.
LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE(1)
 
(NMP/100 mL)
UFC/100 mL
Organismos/100mL
Coliformes Totales.
<1,1
CERO
Ausencia
Pseudomonas aeruginosa(2).
<1,1
CERO
No aplica
Enterococos fecales(3).
<1,1
CERO
Ausencia
Esporas de Clostridium sulfito reductores(2, 3).
<1,1
CERO
No aplica
(1) La unidad a informar será de acuerdo al método utilizado.
(2) Especificaciones sólo para agua mineral natural.
(3) La autoridad sanitaria establecerá los casos en que se realizará la determinación de estas especificaciones.
5.1.5.1.3 Metales, metaloides y compuestos inorgánicos.
ESPECIFICACIÓN
LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE
(mg/L)
Antimonio.
0,005
Arsénico.
0,01
Bario.
0,70
Borato como B.
5,00
Cadmio.
0,003
Cromo total.
0,05
Cobre.
1,00
Cianuro.
0,07
Fluoruros como F-.
0,70(5)
2,0(6)
Manganeso.
0,40
Mercurio.
0,001
Níquel.
0,02
Nitrógeno de nitratos.
10,00
Nitrógeno de nitritos.
0,06
Plomo.
0,01
Selenio.
0,01
(5)No aplica para aguas minerales naturales.
(6)Aplica para aguas minerales naturales, ver apartado de Etiquetado.
5.1.5.1.4 Compuestos orgánicos sintéticos.
ESPECIFICACIÓN.
LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE
(mg/L).
Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos.
0,0005
Compuestos orgánicos no halogenados.
0,01
Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables.
0,001
Carbono Orgánico Purgable.
0,01
Sustancias activas al azul de metileno.
0,5
5.1.5.1.5 Desinfectantes.
ESPECIFICACIÓN.
LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE
(mg/L).
Cloro residual libre.
0,1
 
5.1.5.1.6 Subproductos de desinfección.
DESINFECTANTE
UTILIZADO.
ESPECIFICACIÓN.
LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE
(mg/L).
Cloro
Formaldehído.
0,9
Bromodiclorometano.
0,06
Bromoformo.
0,1
Dibromoclorometano.
0,1
Cloroformo.
0,2
Ozono
Formaldehído.
0,9
Bromato.
0,01
 
5.1.5.1.6.1 En aguas minerales naturales, los subproductos de desinfección deberán estar ausentes.
5.1.5.1.7 Radiactivos.
ESPECIFICACIÓN.
LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE
(Bq/L).
Radiactividad beta total (7).
1,85
Radiactividad alfa total (7).
0,56
(7) Aplica para aguas minerales naturales.
5.1.5.2 Aditivos y coadyuvantes de proceso.
Cuando se adicione al producto dióxido de carbono o anhídrido del ácido carbónico, nitrógeno o poliacrilamida se deberá sujetar a lo especificado en el ACUERDO.
5.1.5.3 Materia Extraña.
5.1.5.3.1 Ausente en cualquier presentación del producto terminado.
5.2 Hielo.
5.2.1 El proceso de fabricación de hielo debe cumplir con las especificaciones sanitarias del agua para consumo humano, además de las siguientes disposiciones:
5.2.1.1 Establecimientos.
5.2.1.1.1 Se debe contar con un dispositivo con solución suficiente para desinfección de calzado al ingreso de las áreas de llenado de moldes, desmoldado, corte, almacenamiento y envasado. Las personas que ingresen deberán desinfectar su calzado en estos dispositivos.
5.2.1.1.2 El andén de despacho debe ser desinfectado al inicio de las operaciones.
5.2.1.1.3 En los casos en que por operación sea necesario desplazar el hielo sobre el piso o cualquier otra superficie en las áreas de proceso o almacenamiento, éstas deberán limpiarse diariamente y desinfectarse con la frecuencia que sea necesaria, de tal forma que durante el manejo del hielo se evite el riesgo de contaminación del producto.
5.2.1.1.4 El llenado de los moldes debe hacerse a través de tubería fija.
5.2.1.1.5 Los moldes no deben sumergirse por completo en la salmuera.
5.2.1.1.6 Para el despegue del producto se deberá usar agua que se utiliza como materia prima.
5.2.2 Especificaciones sanitarias del producto.
5.2.2.1 El producto terminado deberá cumplir con las especificaciones establecidas para el agua de consumo humano de esta Norma y comercializarse preenvasado.
6. Control Sanitario del agua y hielo para consumo humano
6.1 Se debe contar con un programa de muestreo, el cual debe indicar como mínimo, el número de muestras que deben examinarse, el tamaño de esas muestras, el método de análisis empleado y su sensibilidad, el número de muestras y cantidad de microorganismos que harán que el lote se considere inaceptable o fuera de especificaciones.
6.2 La frecuencia mínima de análisis de las especificaciones del producto terminado debe ser de acuerdo a los requisitos establecidos en el Cuadro 1 de esta Norma y deberá documentarse en bitácoras o registros.
Cuadro 1. Frecuencia mínima de análisis de agua y hielo.
ESPECIFICACIÓN.
FRECUENCIA.
Organolépticos y físicos.
Mensual.
Coliformes totales.
Semanal.
Metales, metaloides y compuestos inorgánicos.
Anual.
Compuestos orgánicos sintéticos.
Anual.
Desinfectantes.
Cada cuatro horas.
Subproductos desinfección.
Anual.
Radiactivos.
Cada cinco años.
 
6.3 Para metales, metaloides y compuestos inorgánicos, compuestos orgánicos sintéticos y radiactivos, se modificará la frecuencia de muestreo señalada en el Cuadro 1 de esta Norma a trimestral, cuando se compruebe que la fuente de abastecimiento contenga niveles más altos de los límites máximos permisibles señalados en esta Norma.
6.4 En la prueba de Pseudomonas aeruginosas la frecuencia debe ser mensual y cuando se demuestre mediante información asentada en bitácora que se encuentra ausente a lo largo de 12 meses, la frecuencia será trimestral.
7. Procedimiento de evaluación de la conformidad
7.1 La evaluación de la conformidad podrá ser solicitada por el representante legal o la persona que tenga facultades para ello, ante la autoridad competente o las personas acreditadas y aprobadas para tales efectos.
8. Etiquetado
8.1 La información sanitaria que debe figurar en la etiqueta de los productos preenvasados objeto de esta Norma, así como en los envases que pongan las empresas a disposición del consumidor, además de cumplir con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana citada en el punto 2.3, del capítulo de Referencias, de esta Norma, deberá ajustarse a lo siguiente:
8.2 Se debe declarar:
 
8.2.1 Cuando se utilice anhídrido carbónico, éste debe reportarse con el nombre común o los sinónimos establecidos en el ACUERDO, el agua adicionada con anhídrido carbónico podrá nombrarse como agua carbonatada o gasificada.
8.2.2 En el caso del hielo deberá ostentar la leyenda "Hielo para consumo humano".
8.2.3 Para el agua mineral natural, si el producto contiene más de 0.7 mg/L de fluoruro, en la etiqueta debe aparecer como parte del nombre del producto o en un lugar visible muy cerca de éste, la siguiente frase: "Contiene fluoruro". Además, cuando el producto contenga más de 1.5 mg/L de fluoruro, se debe incluir en la etiqueta la siguiente frase: "Este producto no es apto para lactantes y niños menores de siete años".
8.3 No se permite, además de lo especificado en la Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010 (véase punto 2.3, del capítulo de Referencias, de esta Norma), lo siguiente en el etiquetado y la publicidad del producto terminado:
8.3.1 Declaraciones que indiquen que el producto ha adquirido un valor especial o superior gracias a la adición de minerales o la modificación de sus propiedades tales como pH, estructura molecular, conductividad, cantidad de oxígeno, entre otros.
8.3.2 Ostentar leyendas de que el producto por sí solo sirve para adelgazar, variar las proporciones del cuerpo o bien para el control de peso.
8.3.3 Declarar u ostentar de forma escrita, gráfica o descriptiva, que los productos, su uso, ingredientes o cualquier otra característica, están recomendados, respaldados o aceptados por centros de investigación, asociaciones, entre otros.
8.4 Se podrán utilizar aquellas declaraciones de calidad de índole ecológico, religioso o de certificaciones de calidad de producto respecto a una Norma Mexicana o Norma Oficial Mexicana, siempre y cuando no se utilicen para hacer declaraciones superlativas o comparativas con otros productos equivalentes.
9. Concordancia con normas internacionales
9.1 Esta Norma es parcialmente equivalente con la CODEX STAN 108-1981. Revisiones: 1997, 2008.
10. Bibliografía
10.1 Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias.
10.2 ISO 7704: 1985 Water quality-Evaluation of membrane filters used for microbiologial analyses.
10.3 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association. 21th Ed. Washington D.C. 2005. EUA.
10.4 WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. 3th Edition, Vol. 1. World Health Organization. Geneva, 2004.
11. Observancia de la Norma
11.1 La vigilancia del cumplimiento de esta Norma Oficial Mexicana corresponde a la Secretaría de Salud y a los Gobiernos de las Entidades Federativas en sus respectivos ámbitos de competencia.
12. Vigencia
12.1 Esta Norma entrará en vigor a los 120 días naturales después de su publicación en el Diario Oficial de la Federación.
TRANSITORIO
ÚNICO.- La entrada en vigor de esta norma, deja sin efectos a la Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasados a granel. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 18 de octubre de 2002.
 
Sufragio Efectivo, No Reelección.
México, D.F., a 28 de octubre de 2015.- El Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, Mikel Andoni Arriola Peñalosa.- Rúbrica.
Apéndice normativo A. Métodos de pruebas microbiológicas y fisicoquímicas.
A.1. Símbolos, abreviaturas y definiciones.
A.1.1
HCN
Ácido cianhídrico.
A.1.2
HCI
Ácido clorhídrico.
A.1.3
NWRI-HPCA
Agar cuenta en placa heterotrófica del NWRI.
A.1.4
m-HPCA
Agar membrana cuenta de placa heterotrófica.
A.1.5
R2A
Agar Resorner´s 2A
A.1.6
PSE
Agar Selectivo para Enterococos Pfizer.
A.1.7
As
Arsénico.
A.1.8
AOAC
Association of Official Analytical Chemists (por sus siglas en inglés).
A.1.9
CO2
Bióxido de carbono.
A.1.10
Cd
Cadmio.
A.1.11
Cr
Cromo
A.1.12
cm
Centímetro.
A.1.13
cm2
Centímetro cuadrado.
A.1.14
KCN
Cianuro de potasio.
A.1.15
CNCI
Cloruro de cianógeno.
A.1.16
AOX
Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles.
A.1.17
Co
Cobalto.
A.1.18
DGN
Dirección General de Normas.
A.1.19
SPA
Establecimientos Salud por Agua.
A.1.20
°C
Grado Celsius.
A.1.21
g
Gramo.
A.1.22
h
Hora.
A.1.23
F-
Ión fluoruro.
A.1.24
kPa
Kilopascal.
A.1.25
L
Litro.
A.1.26
±
Más menos.
A.1.27
>
Mayor o igual que
A.1.28
<
Menor o igual que
A.1.29
Hg
Mercurio.
A.1.30
P-A
Método de presencia ausencia.
A.1.31
µ
Microohm.
A.1.32
µg
Microgramo.
A.1.33
µL
Microlitro.
A.1.34
µm
Micrómetro.
A.1.35
mL
Mililitro.
A.1.36
mg
Miligramo.
A.1.37
mg/L
Miligramo por litro.
A.1.38
mm
Milímetro.
 
A.1.39
µS/cm
MicroSiemens por centímetro
A.1.40
mv
Milivolts.
A.1.41
RMV
Milivolts relativos.
A.1.42
min
Minuto.
A.1.43
M
Molar.
A.1.44
MCC
Muestra de control de calidad.
A.1.45
MCI
Muestra de control de calidad interno.
A.1.46
DPD
N,N-dietil-p-difenildiamina.
A.1.47
nm
Nanómetro.
A.1.48
NWRI
National Water Research Institute (Por sus siglas en inglés).
A.1.49
Ni
Níquel
A.1.50
No.
Número.
A.1.51
NMP
Número Más Probable.
A.1.52
ppm
Partes por millón.
A.1.53
p
Peso.
A.1.54
pg
Picogramo.
A.1.55
Pt
Platino.
A.1.56
Pb
Plomo
A.1.57
PTFE
Politerafluoroetileno.
A.1.58
%
Por ciento.
A.1.59
pH
Potencial de hidrógeno.
A.1.60
rpm
Revoluciones por minuto.
A.1.61
SPANDS
Sal trisódica del ácido 1,8-dihidroxi-2-(4- sulfofenilazo) naftalen-3,6-disulfónico.
A.1.62
FIAS
Sistemas automatizados de inyección en flujos continuos.
A.1.63
s
Segundo.
A.1.64
Se
Selenio.
A.1.65
N
Solución normal.
A.1.66
ABS
Sulfonato de Aquil Benceno.
A.1.67
SAAM
Sustancias Activas al Azul de Metileno
A.1.68
TFE
Tetrafluoroetileno.
A.1.69
THM
Triahalometanos.
A.1.70
mol
Unidad de la cantidad de sustancia y se define la cantidad de sustancia que contiene tantas unidades elementales como existan átomos en 0,012 kg de carbono 12.
A.1.71
UFC
Unidades Formadoras de Colonias.
A.1.72
UNT
Unidades Nefelométricas de Turbiedad.
A.1.73
UV
Ultravioleta.
A.1.74
M-PA
Medio Pseudomonas Aeruginosa.
A.1.75
M-PAC
Medio Pseudomonas Aeruginosa Compuesto.
A.1.76
DRCM
Medio diferencial reforzado para clostridia.
A.1.77
Agua Tipo I
Al agua con una conductividad eléctrica 0.1 mS/cm a 25 °C como máximo y Resistividad > 10 M.
 
A.1.78
Agua Tipo II
Al agua con una conductividad eléctrica 1.0 mS/cm a 25 °C como máximo y Resistividad > 1 M.
A.1.79
Blanco de curva
A la disolución del ácido usado como diluyente
A.1.80
Blanco de reactivos
A la disolución que contiene todos los reactivos usados en los mismos volúmenes y concentraciones en el procesamiento de la muestra. Este blanco debe seguir los pasos de digestión y preparación de la muestra.
A.1.81
Blanco fortificado
A la disolución que se prepara a partir de una alícuota del blanco de reactivos, añadiendo una alícuota de la disolución estándar concentrada "disolución madre", para dar una concentración final que produzca una absorbancia aceptable (aproximadamente 0,1) para el analito. El blanco de reactivos fortificado debe seguir el mismo esquema de digestión y preparación de la muestra.
A.1.82
Blanco de método
A la alícuota de agua destilada a la cual, junto a las muestras de control de calidad, de control de calidad interno y fortificada, se le sigue todo el procedimiento.
A.1.83
Carbono inorgánico
A los carbonatos, bicarbonatos y CO2.
A.1.84
Carbono orgánico disuelto
A la fracción del carbono orgánico que pasa a través de filtro de fibra de vidrio con poro de 0.45 µm de diámetro.
A.1.85
Espectrometría de absorción atómica
A una rama del análisis instrumental en el cual un elemento es atomizado en forma tal que permite la observación, selección y medida de su espectro de absorción.
A.1.86
Espectrometría de absorción atómica por flama
Al método por el cual el elemento se determina mediante un espectrómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un sistema de nebulización y una fuente de atomización. La fuente de atomización es un quemador que utiliza diferentes mezclas de gases, las más frecuentes son aire-acetileno y óxido nitroso-acetileno.
A.1.87
Espectrometría de absorción atómica con horno de grafito
Al método mediante el cual el elemento se determina por un espectrómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un horno de grafito. El principio es esencialmente el mismo que en absorción atómica de aspiración directa en flama, excepto que se usa un horno en lugar de la flama para atomizar la muestra.
 
A.1.88
Espectrometría de absorción atómica con generación de hidruros
Es un método similar al del vapor frío. Las muestras reaccionan en un dispositivo externo con un agente reductor, generalmente borohidruro. Los productos gaseosos de reacción se llevan a una celda de muestreo que se encuentra en el paso óptico del espectrómetro de absorción atómica, en este caso, los productos de reacción son hidruros volátiles. Estos compuestos moleculares no son capaces de dar una señal de absorción atómica, por lo tanto la celda se calienta para disociar el hidruro gaseoso en átomos libres. Cuando el hidruro gaseoso se disocia en la celda calentada en átomos libres, la absorción atómica crece y cae a medida que se crean los átomos y escapan de la celda de absorción. Se mide el máximo de absorción o altura de pico, como señal analítica. Los elementos que se pueden determinar con esta técnica son: As, Pb, Sb, Se.
A.1.89
Espectrometría de absorción atómica con vapor frío
Al método que es otra aproximación para mejorar la sensibilidad de la absorción atómica, optimizando la eficiencia de muestreo en el quemador de pre-mezcla, en donde el mercurio se reduce químicamente al estado atómico libre haciendo reaccionar la muestra con un reductor fuerte (cloruro estanoso o borohidruro de sodio) en un recipiente de reacción cerrado. El mercurio volátil libre se arrastra del matraz de reacción burbujeando aire o nitrógeno a través de la disolución. Los átomos del mercurio que se arrastran son transportados a una celda de absorción que se coloca en el paso de luz del espectrómetro de absorción atómica. A medida que los átomos de mercurio pasan por la celda de muestreo, la absorbancia medida se incrementa indicando el aumento de concentración en el paso de luz.
A.1.90
Límite de detección, sensibilidad, y rangos de concentración
La sensibilidad del espectrómetro de absorción atómica de flama es definido como la concentración que el metal produce en una absorción del 1% (una absorbancia de aproximadamente 0.0044). El límite de detección del instrumento es definido como la concentración que produce la absorción equivalente a dos veces la magnitud de la fluctuación de fondo. La sensibilidad y el límite de detección varían de acuerdo al instrumento.
A.1.91
Métodos de prueba
A los procedimientos analíticos utilizados en el laboratorio para comprobar que un producto satisface las especificaciones que establece la Norma.
A.1.92
Muestra de control de calidad
A una muestra externa al laboratorio, que contiene una alícuota de concentración conocida del analito, cuyos valores de absorbancia deben estar comprendidos en el intervalo lineal del método.
A.1.93
Muestra de control de calidad Interno
A una disolución con el analito a determinar, preparada a partir de una marca o número de lote diferente al estándar utilizado en la curva de calibración.
A.1.94
Muestra fortificada
A la muestra a la cual se le adiciona una alícuota de concentración conocida del analito, diluida en el ácido apropiado de tal forma que la disolución resultante tenga una absorbancia dentro del intervalo lineal de la curva.
 
A.2. Métodos de pruebas microbiológicas.
A.2.1 Método de prueba para la determinación Pseudomonas aeruginosa.
A.2.1.1 Método de prueba para el NMP.
A.2.1.1.1 Fundamento.
Es un método de estimación probabilística de la densidad bacteriana presente en una muestra, basada en la dilución de la misma, sembrada e incubada en réplicas de tubos con caldo asparagina, que en presencia de luz UV produce un pigmento verde fluorescente (prueba presuntiva). La prueba confirmativa consiste en sembrar cada uno de los tubos que producen fluorescencia en medio de acetamida. La Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de desaminar la acetamida en amoniaco alcalinizando el medio y desarrollando un color rojo que se detecta con ayuda del indicador rojo de fenol.
Las Pseudomonas aeruginosa, es un bacilo Gram negativo, aerobio, con flagelos polares que pertenece a la Familia Pseudomonadaceae. En medios adecuados produce un pigmento azulado llamado piocianina. Muchas cepas también producen pigmentos pero de color verde fluorescente (fluoresceína). Son catalasa y oxidasa positivas y producen amoniaco a partir de la arginina. Crecen en citrato como única fuente de carbono.
La Pseudomonas aeruginosa es un organismo común en el medio ambiente y se puede encontrar en heces, tierra, agua y aguas residuales. Se multiplica en el agua y se considera como una de las principales causas de enfermedades nosocomiales.
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria que rara vez causa enfermedad seria en individuos sanos y se le considera como patógeno oportunista. Predominantemente causa daños en quemaduras, heridas, tracto respiratorio de personas enfermas e infecciones en ojos. En pacientes inmunocomprometidos puede causar infecciones pulmonares. También produce foliculitis asociadas a aguas de albercas y SPA contaminados. Muchas cepas son resistentes a varios agentes antimicrobianos".
No hay evidencias de que el agua contaminada con Pseudomonas aeruginosa haya sido fuente de infección para la población en general, pero en personas con alta susceptibilidad como niños, ancianos y personas inmunocomprometidas constituye un riesgo para la salud, por lo que se convierte en un microorganismo de importancia sanitaria. La presencia de altos índices de Pseudomonas aeruginosa está asociada a quejas acerca del sabor, olor y turbiedad y no así a brotes.
A.2.1.1.2 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.
A.2.1.1.2.1 Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.
A.2.1.1.2.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio deberá esterilizarse mediante horno, durante 2 h de 170°C a 175°C o 1 h a 180°C o en autoclave, a 121 ±1.0°C durante 15 min como mínimo.
A.2.1.1.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios de cultivo.
A.2.1.1.2.4 El laboratorio debe tener claramente definido un sistema de control de calidad, para asegurar que los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.
A.2.1.1.2.5 Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con un pH de 5 a 7.
A.2.1.1.2.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
A.2.1.1.3 Materiales.
A.2.1.1.3.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 mL y 1 mL, con tapón de algodón y divisiones de 0.1 mL.
A.2.1.1.3.2 Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total o un dispensador de líquidos equivalente.
A.2.1.1.3.3 Frascos de vidrio de 500 mL y un litro con tapón de rosca.
A.2.1.1.3.4 Tubos de 16 x 150 mm y 18 x 200 mm con tapón de rosca.
A.2.1.1.3.5 Botellas de dilución de borosilicato de boca ancha con tapón de rosca.
A.2.1.1.3.6 Mechero de Bunsen.
A.2.1.1.3.7 Gradillas de plástico o metal.
A.2.1.1.3.8 Asas bacteriológicas de 3 mm a 3.5 mm de diámetro con portaasa.
A.2.1.1.3.9 Lentes protectores.
A.2.1.1.3.10 Termómetro de inmersión parcial con división mínima de 1°C para incubadora calibrado o verificado.
A.2.1.1.3.11 Termómetro de máximas para autoclave con división mínima de 0.5°C calibrado o ciclos de esterilización validados.
A.2.1.1.3.12 Cinta testigo para procesos de esterilización por calor húmedo.
A.2.1.1.3.13 Probetas de 100, 500 y 1000 mL.
A.2.1.1.4 Medios de cultivo, reactivos y soluciones.
A.2.1.1.4.1 Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.
A.2.1.1.4.2 Caldo asparagina.
Ingrediente.
Cantidad.
Concentración
sencilla (1X).
Concentración
doble (2X).
Concentración
triple (3X).
Concentración
séxtuple (6X).
1mL o 0.1 mL de
muestra con 10
mL de caldo.
10 mL muestra
con 10 mL de
caldo.
100 mL de
muestra con 50
mL de caldo.
100 mL de
muestra con 20
mL de caldo.
Asparagina, DL
3.0 g
6.0 g
9.0 g
18.0 g
K2HPO4, fosfato
dipotásico anhidro
monohidrogenado.
1.0 g
2.0 g
3.0 g
6.0 g
MgSO47H2O,
Sulfato de
magnesio.
0.5 g
1.0 g
1.5 g
3.0 g
Agua.
1 L
1 L
1 L
1 L
 
A.2.1.1.4.2.1 Preparación.
A.2.1.1.4.2.1.1 Disolver todos los ingredientes en un litro de agua y ajustar a pH de 6.9 a 7.2 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1N según se requiera. Distribuir en volúmenes adecuados de acuerdo a la concentración sencilla, doble o según se requiera. Esterilizar durante 15 min a 121°C ±1.0°C. Después de la esterilización, el pH debe estar dentro del intervalo descrito y los volúmenes finales deben ser iguales a lo indicado en la tabla (véase tabla A.2.1.1.4.2).
NOTA: En caso de no contar con fórmula comercial deshidratada, preparar por ingredientes.
A.2.1.1.4.3 Caldo acetamida.
Ingrediente.
Cantidad.
Acetamida.
10.0 g
NaCl, cloruro de sodio.
5.0 g
K2HPO4, fosfato dipotásico anhidromonohidrogenado.
1.39 g
KH2PO4, fosfato monopotásico anhidro dihidrogenado.
0.73 g
MgSO47 H2O, Sulfato de magnesio
0.5 g
Agua.
1 L
 
A.2.1.1.4.3.1 Preparación:
A.2.1.1.4.3.1.1 Disolver todos los ingredientes en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2 + 0.1 con hidróxido de sodio 0.1 N o HCl 0.1 N según se requiera. Vaciar la solución a un matraz volumétrico de un litro y aforar con agua.
A.2.1.1.4.3.1.2 Pesar 1.2 g de rojo de fenol y disolver en 100 mL de solución de NaOH 0.1 N y adicionar 1 mL por litro de caldo acetamida. La solución de rojo de fenol concentrada se puede utilizar hasta 1 año después de su preparación.
A.2.1.1.4.3.1.3 Distribuir en volúmenes de 10 mL. Esterilizar durante 15 min a 121°C ±1.0°C. Después de la esterilización, el pH debe ser de 7.0 ±0.2.
A.2.1.1.4.3.1.4 Sí se prefiere utilizar agar inclinado, adicionar 15 g de agar por litro de medio. Calentar para disolver el agar y distribuir 8 mL en tubos de 16 x 150 mm. Esterilizar y enfriar inclinando los tubos para obtener un bisel largo.
NOTA: En caso de no contar con fórmula comercial deshidratada, preparar por ingredientes.
A.2.1.1.4.4 Etanol al 70%.
Ingrediente.
Cantidad.
Etanol al 95%.
700 mL
Agua destilada.
Adicionar hasta un volumen final de
1000 mL
 
A.2.1.1.4.5 Soluciones diluyentes.
A.2.1.1.4.5.1 Solución concentrada reguladora de fosfatos.
Ingrediente.
Cantidad.
Fosfato de sodio monobásico.
34.0 g
Agua.
1.0 L
 
A.2.1.1.4.5.1.1 Preparación:
A.2.1.1.4.5.1.1.1 Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2 ± 0.2 con solución de hidróxido de sodio 0.1 N o una solución de HCl 0.1 N según se requiera. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 min a 121°C ± 1.0°C. Conservar en refrigeración.
A.2.1.1.4.5.1.2 Solución de trabajo.
A.2.1.1.4.5.1.2.1 Medir 1.25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua. Distribuir en porciones de 450 mL, 225 mL, 99 mL, 90 mL y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121°C ± 1.0°C durante 15 min. Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser de acuerdo a lo requerido y el pH debe estar dentro del intervalo descrito.
A.2.1.1.4.6 Agua peptonada.
Ingrediente.
Cantidad.
Peptona.
1.0 g
Cloruro de sodio.
8.5 g
Agua.
1.0 L
 
A.2.1.1.4.6.1 Preparación.
A.2.1.1.4.6.1.1 Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.1 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 2°C a 5°C por un tiempo no mayor de 1 mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
A.2.1.1.5 Aparatos e instrumentos.
A.2.1.1.5.1 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ±1.0°C, provista con termómetro calibrado y/o verificado.
A.2.1.1.5.2 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C, con termómetro calibrado y/o verificado.
A.2.1.1.5.3 Termómetro de máximas calibrado o ciclo de esterilización validado.
A.2.1.1.5.4 Lámpara de luz UV de longitud de onda de 360 ±20 nm.
A.2.1.1.5.5 Potenciómetro con sensibilidad de 0.1 de unidad de pH.
A.2.1.1.5.6 Autoclave que alcance una temperatura de 121°C con termómetro calibrado y previamente evaluada con esporas de Geobacillus stearothermophilus.
A.2.1.1.5.7 Balanza granataria calibrada
A.2.1.1.6 Preparación y conservación de las muestras.
A.2.1.1.6.1 Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra con etanol o isopropanol al 70%.
A.2.1.1.6.2 Realizar diluciones decimales cuando proceda.
A.2.1.1.7 Recomendaciones generales previas para al análisis de la muestra.
A.2.1.1.7.1 Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a ¾ de lleno, deberán agitarse 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 s, para asegurar una unidad analítica representativa.
A.2.1.1.7.2 Como alternativa al uso de campanas de fermentación (Durham) utilizar púrpura de bromocresol a una concentración de 0.01 g/L al medio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de este indicador.
 
Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra.
A.2.1.1.8 Procedimiento.
A.2.1.1.8.1 Prueba presuntiva.
A.2.1.1.8.1.1 Utilizar 5 tubos con caldo asparagina por cada porción de 10 mL, 1 mL y 0.1 mL de muestra. Para inóculos de 10 mL de agua, preparar el medio a doble concentración y para volúmenes de 1 y 0.1 mL a concentración sencilla. Hacer diluciones decimales de la muestra cuando se considere necesario con solución reguladora de fosfatos o agua peptonada.
A.2.1.1.8.1.2 Incubar los tubos a 35°C ±1°C por 48 h. Examinar los tubos con una lámpara de luz UV en cuarto oscuro. La producción de un pigmento verde fluorescente se considera como una prueba presuntiva positiva.
A.2.1.1.9 Prueba confirmativa.
A.2.1.1.9.1 Inocular 0.1 mL de cada uno de los tubos positivos en caldo acetamida o en la superficie de agar acetamida inclinado.
A.2.1.1.9.2 Incubar los tubos de 35°C ± 1°C. El desarrollo de un color rojo (pH alcalino) dentro de las 24 a 36 h se considera como una prueba confirmativa para Pseudomonas aeruginosa.
A.2.1.1.10 Expresión de los resultados.
A.2.1.1.10.1 Cálculos.
A.2.1.1.10.2 Calcular la densidad de Pseudomonas aeruginosa por el número más probable en 100 mL con el número de tubos confirmados (véase tabla A.2.1.1.1.4.3).
A.2.1.1.10.3 Considerar en el cálculo del resultado final la(s) dilución(es) realizada(s) cuando proceda.
A.2.1.1.11 Interpretación de resultados.
A.2.1.1.11.1 El desarrollo de un color rojo en los tubos con caldo acetamida o placas con agar acetamida dentro de las 24 h a 36 h incubados de 35°C ±1°C se considera como una prueba confirmativa para Pseudomonas aeruginosa.
A.2.1.1.12 Criterios de validez de la prueba.
A.2.1.1.12.1 Esta prueba tiene validez cuando todos los tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución mayor sean negativos o la combinación de ambos cuando la muestra contenga Pseudomonas aeruginosa y así mismo cuando se inocule un cultivo de referencia con 100 UFC.
A.2.1.1.13 Índices de reproducibilidad y repetibilidad.
A.2.1.1.13.1 Basado en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados analíticos deben estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.
A.2.1.1.13.2 La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%.
A.2.1.1.14 Informe de prueba.
A.2.1.1.14.1 Informar como:
A.2.1.1.14.2 Pseudomonas aeruginosa: (véase tabla A.2.1.1.1.4.3) NMP/100 mL.
Tabla A.2.1.1.1.4.3 Número más probable (NMP) para 100 mL de muestra cuando se utilizan 5 porciones en cada una de 3 diluciones con series geométricas.
No. de Tubos Positivos
No. de Tubos Positivos
No. de Tubos Positivos
No. de Tubos Positivos
No. de Tubos Positivos
No. de Tubos Positivos
10mL
1.0 mL
0.1 mL
NMP
10 mL
1.0 mL
0.1 mL
NMP
10 mL
1.0mL
0.1 mL
NMP
10mL
1.0 mL
0.1 mL
NMP
10 mL
1.0 mL
0.1 mL
NMP
10 mL
1.0 mL
0.1 mL
NMP
0
0
0
<1.8
1
0
0
2
2
0
0
4.5
3
0
0
7.8
4
0
0
13
5
0
0
23
0
0
1
1.8
1
0
1
4
2
0
1
6.8
3
0
1
11
4
0
1
17
5
0
1
31
0
0
2
3.6
1
0
2
6
2
0
2
9.1
3
0
2
13
4
0
2
21
5
0
2
43
0
0
3
5.4
1
0
3
8
2
0
3
12
3
0
3
16
4
0
3
25
5
0
3
58
0
0
4
7.2
1
0
4
10
2
0
4
14
3
0
4
20
4
0
4
30
5
0
4
76
0
0
5
9.0
1
0
5
12
2
0
5
16
3
0
5
23
4
0
5
36
5
0
5
95
0
1
0
1.8
1
1
0
4
2
1
0
6.8
3
1
0
11
4
1
0
17
5
1
0
33
0
1
1
3.6
1
1
1
6.1
2
1
1
9.2
3
1
1
14
4
1
1
21
5
1
1
46
0
1
2
5.5
1
1
2
8.1
2
1
2
12
3
1
2
17
4
1
2
26
5
1
2
64
0
1
3
7.3
1
1
3
10
2
1
3
14
3
1
3
20
4
1
3
31
5
1
3
84
0
1
4
9.1
1
1
4
12
2
1
4
17
3
1
4
23
4
1
4
35
5
1
4
110
0
1
5
11
1
1
5
14
2
1
5
19
3
1
5
27
4
1
5
42
5
1
5
130
0
2
0
3.7
1
2
0
6.1
2
2
0
9.3
3
2
0
14
4
2
0
22
5
2
0
49
0
2
1
5.5
1
2
1
8.2
2
2
1
12
3
2
1
17
4
2
1
26
5
2
1
70
0
2
2
7.4
1
2
2
10
2
2
2
14
3
2
2
20
4
2
2
32
5
2
2
95
0
2
3
9.2
1
2
3
12
2
2
3
17
3
2
3
24
4
2
3
38
5
2
3
120
0
2
4
11
1
2
4
15
2
2
4
19
3
2
4
27
4
2
4
44
5
2
4
150
0
2
5
13
1
2
5
17
2
2
5
22
3
2
5
31
4
2
5
50
5
2
5
180
0
3
0
5.6
1
3
0
8.3
2
3
0
12
3
3
0
17
4
3
0
27
5
3
0
79
0
3
1
7.4
1
3
1
10
2
3
1
14
3
3
1
21
4
3
1
33
5
3
1
110
0
3
2
9.3
1
3
2
13
2
3
2
17
3
3
2
24
4
3
2
39
5
3
2
140
0
3
3
11
1
3
3
15
2
3
3
20
3
3
3
28
4
3
3
45
5
3
3
180
0
3
4
13
1
3
4
17
2
3
4
22
3
3
4
31
4
3
4
52
5
3
4
210
0
3
5
15
1
3
5
19
2
3
5
25
3
3
5
35
4
3
5
59
5
3
5
250
0
4
0
7.5
1
4
0
11
2
4
0
15
3
4
0
21
4
4
0
34
5
4
0
130
0
4
1
9.4
1
4
1
13
2
4
1
17
3
4
1
24
4
4
1
40
5
4
1
170
0
4
2
11
1
4
2
15
2
4
2
20
3
4
2
28
4
4
2
47
5
4
2
220
0
4
3
13
1
4
3
17
2
4
3
23
3
4
3
32
4
4
3
54
5
4
3
280
0
4
4
15
1
4
4
19
2
4
4
25
3
4
4
36
4
4
4
62
5
4
4
350
0
4
5
17
1
4
5
22
2
4
5
28
3
4
5
40
4
4
5
69
5
4
5
430
0
5
0
9.4
1
5
0
13
2
5
0
17
3
5
0
25
4
5
0
41
5
5
0
240
0
5
1
11
1
5
1
15
2
5
1
20
3
5
1
29
4
5
1
48
5
5
1
350
0
5
2
13
1
5
2
17
2
5
2
23
3
5
2
32
4
5
2
56
5
5
2
540
0
5
3
15
1
5
3
19
2
5
3
26
3
5
3
37
4
5
3
64
5
5
3
920
0
5
4
17
1
5
4
22
2
5
4
29
3
5
4
41
4
5
4
72
5
5
4
1600
0
5
5
19
1
5
5
24
2
5
5
32
3
5
5
45
4
5
5
81
5
5
5
>1600
Fuente: AOAC 18a. Edición. Revisión 2, 2007 Table 978.23.
A.2.1.2 Método de presencia ausencia (P-A).
A.2.1.2.1 Fundamento.
Es una modificación del método de NMP simplificado, que permite utilizar volúmenes grandes de muestra (100 mL) para obtener información cualitativa de presencia ausencia de Pseudomonas aeruginosa.
Transferir 100 mL de muestra de agua a un volumen de 50 mL o 20 mL de caldo asparagina. Considerar el volumen final de muestra y caldo para ajustar la concentración de medio (véase A.2.1.14), continuar de acuerdo a lo indicado (véase A.2.1.1.8.1.2).
A.2.1.2.2 Expresión de los resultados.
 
A.2.1.2.2.1 El desarrollo de un color rojo en los tubos con caldo acetamida o placa o agar acetamida dentro de las 24 h a 36 h incubados de 35°C ±1°C, se considera como una prueba confirmativa para la presencia de Pseudomonas aeruginosa.
A.2.1.2.3 Informe de prueba.
A.2.1.2.3.1 Presencia de Pseudomonas aeruginosa en 100 mL. o
A.2.1.2.3.2 Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 100 mL.
A.2.1.3 Método de filtración por membrana.
A.2.1.3.1 Fundamento.
Es un método que se basa en la filtración de un volumen específico de agua a través de un filtro de membrana con tamaño de poro de 0.45 mm. El filtro es colocado en un agar selectivo incubado a 41.5 ±0.5°C.
Las colonias cafés con centro oscuro son confirmadas en agar leche en el cual se hidroliza la caseína produciendo un pigmento de amarillo a verde que se difunde en el agar.
A.2.1.3.2 Materiales.
A.2.1.3.2.1 Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 60 x 15 mm o 50 x 9 mm u otro tamaño apropiado.
A.2.1.3.2.2 Portafiltros esterilizables de plástico, porcelana, acero inoxidable o vidrio.
A.2.1.3.2.3 Matraz Kitazato.
A.2.1.3.2.4 Membranas para filtración estériles con poro de 0.45 µm.
A.2.1.3.2.5 Pinzas de acero inoxidable para membrana.
A.2.1.3.2.5 Contador mecánico o manual de Tally o equivalente.
A.2.1.3.2.6 Portaasa y asa bacteriológica.
A.2.1.3.3 Aparatos e instrumentos.
A.2.1.3.3.1 Bomba de vacío (20-27 pulgadas Hg), tubería y aditamentos herméticos para mantener el vacío.
A.2.1.3.3.2 Sistema de filtración.
A.2.1.3.3.3 Balanza granataria calibrada
A.2.1.3.3.4 Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001 g, calibrada.
A.2.1.3.3.5 Incubadora que evite variaciones mayores de ±0.5°C termómetro calibrado y/o verificado.
A.2.1.3.3.6 Microscopio estereoscópico, óptico o equivalente.
A.2.1.3.4 Medios de cultivo y reactivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.
A.2.1.3.4.1 Agar M-PA.
Ingrediente.
Cantidad.
L-Lisina HCl.
5.0 g
Cloruro de sodio, NaCl.
5.0 g
Extracto de levadura.
2.0 g
Xilosa.
2.5 g
Sacarosa.
1.25 g
Lactosa.
1.25 g
Rojo de fenol.
0.08 g
Citrato férrico amoniacal.
0.8 g
Tiosulfato de sodio, Na2S2O3.
6.8 g
Agar,
15.0 g
Agua,
1 L
 
A.2.1.3.4.1.1 Preparación.
A.2.1.3.4.1.1.1 Disolver todos los ingredientes en un litro de agua, ajustar el pH a 6.5 ±0.1 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera y esterilizar en autoclave. Enfriar a un intervalo entre 55°C a 60°C, reajustar el pH a 7.1 ±0.2 y adicionar los siguientes antibióticos en polvo por cada L de base de agar: sulfapiridina*, 176 mg; kanamicina*, 8.5 mg; ácido nalidíxico*, 37.0 mg; y cicloheximida*, 150 mg. Mezclar y distribuir 3 mL en cajas petri de 50 x 12 mm. Almacenar las placas de 2 a 8°C. Usar el medio durante un período máximo de un mes.
* Sigma Chemical o equivalente.
A.2.1.3.4.2 Agar M-PAC modificado.
A.2.1.3.4.2.1 Este medio se encuentra comercialmente disponible en forma deshidratada y la diferencia en la fórmula del M-PA-C original, es el contenido de sulfato de magnesio 1.5 g, kanamicina 8 mg y ácido nalidíxico 37.0 mg por L.
A.2.1.3.4.2.2 No usar el medio después de una semana de su preparación.
A.2.1.3.4.3 Agar leche (Brown y Scott Foster modificado).
Mezcla A.
Leche descremada.
100 g
Agua.
500 mL
 
Mezcla B.
Caldo nutritivo.
12.5 g
Cloruro de sodio, NaCl.
2.5 g
Agar.
15.0 g
Agua.
500 mL
 
A.2.1.3.4.3.1 Preparación.
A.2.1.3.4.3.1.1 Disolver los ingredientes por separado y esterilizar. Enfriar rápidamente a 55°C. Combinar la mezcla A y B y distribuir porciones de 20 a 25 mL en cajas petri. Dejar solidificar.
A.2.1.3.5 Procedimiento.
A.2.1.3.5.1 Prueba presuntiva.
A.2.1.3.5.1.1 Instalar el equipo de filtración. Filtrar 100 mL de muestra a través del filtro. Enjuagar el embudo mientras se está filtrando, con 1 a 3 porciones de 10 mL a 30 mL de diluyente estéril mientras el filtro continúa en su lugar. Colocar la membrana en placas con agar M-PA modificado. Evitar burbujas de aire entre la membrana y la superficie del agar. Invertir las placas e incubar a 41.5 ±0.5°C por 72 h. Si se sospecha de cuentas altas de Pseudomonas aeruginosa, filtrar 2 porciones por separado de 50 mL ó 4 porciones de 25 mL.
A.2.1.3.5.1.2 Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa son de 0.8 mm a 2.2 mm de diámetro, cafés con centro oscuro elevado.
A.2.1.3.5.1.3 Con ayuda de un cuenta colonias y/o un lente amplificador de 15 a 20 aumentos, seleccionar cajas que contengan entre 20 colonias a 80 colonias típicas y contar el No. de UFC.
A.2.1.3.6 Prueba confirmativa.
A.2.1.3.6.1 Seleccionar colonias aisladas típicas y atípicas y sembrar una estría de 2 cm a 4 cm de longitud en agar leche. Incubar a 36 ±1.0°C por 24 h. La Pseudomonas aeruginosa hidroliza la caseína produciendo un pigmento de amarillo a verde que se difunde en el agar.
 
A.2.1.3.7 Cálculos.
A.2.1.3.7.1 Si se filtraron 2 porciones de 50 mL por separado y se obtuvieron en una membrana 5 y en otras 3 colonias, aplicar la siguiente fórmula:
Fórmula A.2.1.3.7.2

A.2.1.3.8 Expresión de los resultados.
A.2.1.3.8.1 La presencia de colonias aisladas en agar leche incubadas a 35°C ±1.0°C por 24 h, que producen un pigmento de amarillo a verde que se difunde en el agar, se considera la confirmación de la presencia de Pseudomonas aeruginosa.
A.2.1.3.9 Criterios de validez de la prueba.
A.2.1.3.9.1 Esta prueba tiene validez si se obtienen cajas que contengan entre 20 UFC a 80 UFC.
A.2.1.3.10 Informe de prueba.
A.2.1.3.10.1 Informar como:
A.2.1.3.10.2 UFC de Pseudomonas aeruginosa (colonias contadas)/100 mL
A.2.1.3.10.3 Si no se observan colonias informar como:
A.2.1.3.10.4 < 1 UFC de Pseudomonas aeruginosa/100 mL
A.2.1.3.10.5 Si se filtraron 2 porciones de muestra de 50 mL por separado o 4 porciones de 25 mL o menos, aplicar la fórmula A.2.1.3.7.2
A.2.2 Método de prueba para la determinación de esporas de Clostridium sulfito reductores.
A.2.2.1 Fundamento.
Para la detección de esporas anaerobias sulfito-reductoras (clostridia) en una muestra de agua, requiere de las siguientes etapas:
Selección de esporas. La selección de esporas se realiza por la aplicación de calor en un tiempo suficiente para destruir las células vegetativas.
Enriquecimiento del cultivo. La detección y recuento de esporas anaerobias sulfito-reductoras se realiza por inoculación de diferentes volúmenes de la muestra en medio de enriquecimiento líquido, seguido de la incubación a 37°C ±1°C por 44 ±4 horas en condiciones de anaerobiosis.
Este método es aplicable a todo tipo de agua, incluso agua turbia.
Las esporas anaerobias sulfito reductoras (clostridia), están ampliamente distribuidas en el medio ambiente. Presentes en la materia fecal humana y animal, en agua contaminada y en tierra. A diferencia de Escherichia coli y otros organismos coliformes, las esporas sobreviven en agua por largos periodos por ser más resistentes que las formas vegetativas a la acción de factores químicos y físicos. Por lo tanto, nos pueden dar una indicación de contaminación remota o intermitente. Pueden resistir incluso la cloración a niveles normalmente utilizados para el tratamiento del agua y por lo tanto, son útiles para fines de control.
Clostridia: microorganismos anaerobios, formadores de esporas, sulfito-reductores, que pertenecen a la familia Bacillaceae y al género Clostridium.
Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir fielmente y controlar cuidadosamente las condiciones en que se llevan a cabo estos métodos.
A.2.2.2 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.
A.2.2.2.1 Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.
A.2.2.2.2 Todo el material que esté en contacto con la muestra debe estar estéril.
A.2.2.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios de cultivo.
A.2.2.2.4 El laboratorio debe tener implementado un sistema de control de calidad para asegurar que los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.
A.2.2.3 Materiales.
 
A.2.2.3.1 Frascos con tapa de rosca o viales y tapones de vidrio de borosilicato de 200 mL, 100 mL y 25 mL de capacidad.
A.2.2.3.2 Pipetas de 10 y 1 mL de capacidad.
A.2.2.3.3 Tubos de prueba de 150 mm x 13 mm.
A.2.2.3.4 Alambre de fierro.
A.2.2.4 Medios de cultivo, reactivos y diluyentes.
A.2.2.4.1 Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.
A.2.2.4.2 Para mejorar la reproducibilidad de los resultados es recomendable que para la preparación de los diluyentes y el medio de cultivo, sean utilizados componentes básicos deshidratados o el medio completo deshidratado, con su correspondiente certificado de calidad.
A.2.2.4.3 El agua utilizada debe ser destilada o desionizada, libre de substancias que puedan inhibir el desarrollo de microorganismos en las condiciones de la prueba.
A.2.2.4.4 Si el medio de cultivo preparado no se utiliza de inmediato, se debe guardar en la oscuridad, a 4°C, por no más de 1 mes.
A.2.2.4.5 Diluyente.
A.2.2.4.5.1 Los diluyentes que a continuación se describen son los que comúnmente se utilizan en microbiología. Después de su preparación se distribuye en botellas y esterilizar a 121°C ±3°C por 15 min.
A.2.2.4.5.2 Alternativamente se puede distribuir asépticamente después de la esterilización. Almacenar a temperatura ambiente o en refrigeración 5°C ±3°C por un máximo de 6 meses. Si el diluyente presenta algún cambio de su normal apariencia descartarlo.
A.2.2.4.6 Solución salina.
Ingrediente.
Cantidad.
Cloruro de sodio.
8.5 g
Agua.
1 L
 
A.2.2.4.6.1 Preparación.
A.2.2.4.6.1.1 Disolver los ingredientes en agua, si es necesario por calentamiento. Ajustar el pH con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera, después de la esterilización el pH debe ser 7.0 ±0.5 a 25°C
A.2.2.4.7 Diluyente de peptona.
Ingrediente.
Cantidad.
Peptona de caseína.
1.0 g
Agua.
1 L
A.2.2.4.7.1 Preparación.
A.2.2.4.7.1.1 Disolver los ingredientes en agua, si es necesario por calentamiento. Ajustar el pH con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera, después de la esterilización el pH debe ser 7.0 ±0.5 a 25°C.
A.2.2.4.8 Solución buffer de fosfatos.
Ingrediente.
Cantidad.
KH2PO4.
34.0 g
Agua.
1 L
A.2.2.4.8.1 Preparación.
A.2.2.4.8.1.1 Disolver el KH2PO4 en 500 mL de agua. Ajustar el pH con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera a 7.2 ±0.2 a 25°C, adicionar más agua hasta 1000 mL, si la solución necesita ser almacenada esterilizar a 121°C ±3°C.
A.2.2.4.9 Medio diferencial reforzado para clostridia. (DRCM)
 
A.2.2.4.9.1 Medio basal concentración simple.
Ingrediente.
Cantidad.
Peptona de carne.
10.0 g
Extracto de carne.
10.0 g
Extracto de levadura.
1.5 g
Almidón.
1.0 g
Acetato de sodio hidratado.
5.0 g
Glucosa.
1.0 g
Clorhidrato de L-cisteína.
0.5 g
Agua.
1 L
A.2.2.4.9.1.1 Preparación.
A.2.2.4.9.1.2 Mezclar la peptona de carne, el extracto de carne, el acetato de sodio y el extracto de levadura con 800 mL de agua.
A.2.2.4.9.1.3 Con los 200 mL de agua destilada restantes, preparar una solución de almidón de esta manera: mezclar el almidón en un poco de agua fría hasta formar una pasta. Calentar el resto del agua hasta ebullición y lentamente agregar la pasta con agitación constante.
A.2.2.4.9.1.4 Agregar la solución de almidón a la mezcla y caliente a ebullición hasta que se disuelva.
A.2.2.4.9.1.5 Finalmente, adicionar la glucosa y el clorhidrato de L-cisteína hasta que se disuelvan.
A.2.2.4.9.1.6 Ajustar el pH entre 7.1 y 7.2 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N una disolución de HCl 0.1 N según se requiera.
A.2.2.4.9.1.7 Transferir alícuotas de 25 mL del medio en frascos con tapón de rosca con capacidad de 25 mL. Esterilizar en autoclave a 121°C ±1°C por 15 min.
A.2.2.4.9.2 Medio basal doble concentración.
A.2.2.4.9.2.1 Preparar el medio a doble concentración como en el inciso anterior, pero reducir el volumen del agua a la mitad.
A.2.2.4.9.2.2 Transferir alícuotas de 10 mL y 50 mL del medio en frascos con tapa de rosca de 25 mL y de 100 mL de capacidad respectivamente.
A.2.2.4.9.3 Solución de sulfito de sodio (Na2SO3) al 4%.
A.2.2.4.9.3.1 Disolver 4 g de sulfito de sodio anhidro en 100 mL de agua. Esterilizar por filtración a través de membrana con tamaño de poro de 0.45 µm.
A.2.2.4.9.3.2 Almacenar entre 2 a 5°C.
A.2.2.4.9.3.3 Se recomienda preparar una solución reciente cada 14 días.
A.2.2.4.9.4 Solución de citrato férrico (C6H507Fe) al 7%.
A.2.2.4.9.4.1 Disolver 7 g de citrato férrico en 100 mL de agua. Esterilizar por filtración a través de membrana con tamaño de poro de 0.45 µm.
A.2.2.4.9.4.2 Almacenar entre 2 a 5°C.
A.2.2.4.9.4.3 Se recomienda preparar una solución reciente cada 14 días.
A.2.2.4.9.5 Medio completoµµ.
A.2.2.4.9.5.1 El día del análisis, mezcle volúmenes iguales de las soluciones de sulfito de sodio (véase A.2.2.4.9.3) y de citrato férrico (véase A.2.2.4.9.4).
A.2.2.4.9.5.2 Adicionar 0.5 mL de la mezcla (véase A.4.2.2.4.9.5.1) a cada frasco de medio de concentración simple (véase A.4.2.2.4.9.1), que haya sido calentado y enfriado recientemente.
A.2.2.4.9.5.3 Adicionar 0.4 mL de la mezcla (véase A.2.2.4.9.5.1) a cada frasco con 10 mL de medio de doble concentración (véase A.2.2.4.9.2) y 2 mL a cada frasco con 50 mL de medio de doble concentración (véase A.2.2.4.9.2). Tratamiento similar a (véase A.2.2.4.9.5.2).
A.2.2.4.10 Aparatos e instrumentos.
A.2.2.4.10.2 Filtros de membrana estériles, de un poro de 0.2 µm.
A.2.2.4.10.3 Incubadora que mantenga una temperatura de 37°C ±1.0°C.
NOTA: La calidad de los filtros de membrana puede variar de acuerdo a la marca y aun de lote a lote. Por lo tanto, es aconsejable revisar la calidad regularmente de acuerdo a la ISO 7704.
A.2.2.4.11 Preparación de las muestras.
A.2.2.4.11.1 Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra con etanol o isopropanol al 70%.
A.2.2.4.11.2 Realizar diluciones decimales cuando se estime que la carga de esporas de anaerobios sulfito reductores (clostridia), es alta.
A.2.2.4.12 Recomendaciones generales previas al análisis de la muestra.
A.2.2.4.12.1 Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a 3/4 de lleno, deberán agitarse 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 s, para asegurar una unidad analítica representativa.
A.2.2.4.12.2 Como alternativa al uso de campanas de fermentación (Durham) utilizar púrpura de bromocresol a una concentración de 0.01 g/L al medio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de este indicador.
A.2.2.4.12.3 Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra.
A.2.2.4.13 Procedimiento analítico.
A.2.2.4.13.1 Técnica de selección de esporas.
A.2.2.4.13.1.1 Antes de iniciar la prueba, calentar la muestra en baño de agua a 75°C ±5.0°C por 15 min a partir de que se alcance la temperatura. Utilizar periódicamente un frasco similar que contenga el mismo volumen de agua que el de la muestra como control para confirmar que durante el tiempo de calentamiento requerido, la temperatura se mantenga monitoreando con un termómetro.
A.2.2.4.13.2 Inoculación e incubación.
A.2.2.4.13.2.1 Adicionar 50 mL de la muestra (véase A.2.2.4.13.1) a un frasco con tapa de rosca de 100 mL que contenga 50 mL de medio completo de doble concentración (véase A.2.2.4.9.2).
A.2.2.4.13.2.2 Adicionar 10 mL de la muestra (véase A.2.2.4.13.1) a una serie de 5 frascos con tapa de rosca de 25 mL que contenga 10 mL de medio completo de doble concentración (véase A.2.2.4.9.2).
A.2.2.4.13.2.3 Si es necesario, adicionar 1 mL de una dilución 1:10 de la muestra (véase A.2.2.4.13.1) a una serie de 5 frascos con tapa de rosca de 25 mL que contengan 25 mL de medio de concentración simple (véase A.2.2.4.9.3.1).
A.2.2.4.14 Presencia-Ausencia.
A.2.2.4.14.1 Para realizar un examen cualitativo de 100 mL de agua potable o de agua envasada sin hacer una cuenta por NMP, utilizar un frasco de 200 mL con una mezcla de 100 mL de medio completo de doble concentración (véase A.2.2.4.9.2) y adicionar 100 mL de la muestra (véase A.2.2.4.11).
A.2.2.4.14.2 Asegurarse que el volumen de aire remanente en todos los frascos, con medio completo de concentración simple (véase A.2.2.4.9.1) para alcanzar el nivel del volumen del líquido con el cuello del frasco. Sellar los frascos asegurando no tener burbuja o incubar en condiciones de anaerobiosis.
A.2.2.4.14.3 Incubar los frascos inoculados a 37°C ±1°C por 44 ±4 horas.
A.2.2.4.14.4 Volúmenes grandes de cultivos en frascos de vidrio sellados herméticamente pueden explotar por la producción de gas. La adición de un alambre de fierro, calentado a rojo vivo y puesto en el medio antes de la inoculación, creará una atmósfera de la anaerobiosis.
 
A.2.2.4.15 Interpretación de resultados.
A.2.2.4.15.1 Se considera como una prueba positiva los frascos en donde se observe obscurecimiento como resultado de la reducción del sulfito y la precipitación de sulfuro ferroso (II).
A.2.2.4.16 Criterios de validez de la prueba.
A.2.2.4.16.1 Esta prueba tiene validez cuando todos los tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución mayor sean negativos o la combinación de ambos cuando la muestra contenga esporas de Clostridium sulfito reductores o cuando se trate de un cultivo control inoculado con 100 UFC.
A.2.2.4.17 Índices de reproducibilidad y repetibilidad.
A.2.2.4.17.1 Basado en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados analíticos deben estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.
A.2.2.4.17.1 La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%.
A.2.2.4.18 Informe de prueba.
A.2.2.4.18.1 Expresar los resultados como NMP. En el informe de prueba debe establecerse el método empleado y expresar los resultados como NMP de esporas de Clostridium sulfito reductores por 100 mL de muestra. Además debe mencionarse cualquier modificación no especificada en documento o mencionarse como opcional, junto con los detalles de cualquier incidente que pudiera influir en los resultados.
A.2.2.4.18.2 El informe de prueba debe incluir toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra.
NMP de esporas de Clostridium sulfito reductores/100 mL.
Número de tubos positivos
NMP (por 100 mL)
Límites de confianza al 95%
3 de 10 mL
3 de 1 mL
3 de 0.1mL
Inferior
Superior
0
0
1
3
>1
9
0
1
0
3
>1
13
1
0
0
4
>1
20
1
0
1
7
1
21
1
1
0
7
1
23
1
1
1
11
3
36
1
2
0
11
3
38
2
0
0
9
1
36
2
0
1
14
3
37
2
1
0
15
3
44
2
1
1
20
7
88
2
2
0
21
4
47
2
2
1
28
10
149
3
0
0
23
4
120
3
0
1
39
7
130
3
0
2
64
15
379
3
1
0
48
7
210
3
1
1
75
14
230
3
1
2
120
30
380
3
2
0
93
15
380
3
2
1
150
30
440
3
2
2
210
35
470
3
3
0
240
36
1300
3
3
1
460
71
2400
3
3
2
1100
150
4800
 
Tabla A.2.2.4.18.3
Valores de NMP por 100 mL de muestra e intervalos de confianza del 95%, cuando se utiliza 3 tubos con 10 mL, 3 tubos con 1 mL y 3 tubos con 0.1 mL de muestra.
Número de tubos positivos
NMP (por 100 mL)
Límites de confianza al 95%
3 de 50 mL
5 de 10 mL
Inferior
Superior
0
0
>1
 
 
0
1
1
>1
4
0
2
2
>1
6
0
3
4
>1
11
0
4
5
1
13
0
5
7
2
17
1
0
2
>1
6
1
1
3
>1
9
1
2
6
1
15
1
3
9
2
21
1
4
16
4
40
1
5
>18
 
 
 
Tabla A.2.2.4.18.4
Valores de NMP por 100 mL de muestra e intervalos de confianza del 95%, cuando se utiliza una porción de 50 mL y 5 porciones de 10 mL de muestra.
Número de tubos positivos
NMP (por 100 mL)
Límites de confianza al 95%
1 de 50 mL
5 de 10 mL
Inferior
Superior
0
0
>1
 
 
0
1
1
>1
4
0
2
2
>1
6
0
3
4
>1
11
0
4
5
1
13
0
5
7
2
17
1
0
2
>1
6
1
1
3
>1
9
1
2
6
1
15
1
3
9
2
21
1
4
16
4
40
1
5
>18
 
 
 
A.2.2.1 Método de filtración por membrana.
A.2.2.1.1 Fundamento.
La detección de esporas de Clostridium sulfito reductores en una muestra de agua requiere de las siguientes etapas:
Selección de esporas. La selección de esporas en una muestra se realiza por aplicación de calor en un periodo de tiempo suficiente para destruir formas bacterianas vegetativas.
Filtración por membrana y cultivo.
El recuento de esporas de anaerobios sulfito-reductoras se basa en la filtración de un volumen determinado de una muestra de agua, a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro suficiente para retener las bacterias (0.2 µm). La membrana es colocada en el medio selectivo agar sulfito de fierro seguido de una incubación a 37°C ±1°C, por 20 horas ±4 horas y 44 horas ±4 horas, y contar todas las colonias negras.
A.2.2.1.2 Materiales.
A.2.2.1.2.1 Matraces de vidrio (Matraces Erlenmeyer, matraces de bola o matraces de forma cónica), con capacidad de 2 L.
A.2.2.1.2.2 Tubos de ensayo de 160 mm x 16 mm.
A.2.2.1.2.3 Pipetas graduadas, de capacidad de 10 mL, graduadas con divisiones de 0.1 mL.
A.2.2.1.2.4 Cajas Petri.
A.2.2.1.2.5 Filtros de membrana estériles, de un poro de 0.2 µm.
NOTA: La calidad de los filtros de membrana puede variar de acuerdo a la marca y aun de lote a lote. Por lo tanto, es aconsejable revisar la calidad regularmente de acuerdo a la ISO 7704.
A.2.2.1.3 Medios de cultivo y reactivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.
A.2.2.1.3.1 Agar sulfito de fierro.
A.2.2.1.3.1.1 Medio base (agar nutritivo).
Ingrediente.
Cantidad.
Extracto de carne.
3.0 g
Peptona.
10.0 g
Cloruro de sodio (NaCl).
5.0 g
Agar.
15.0 g
Agua.
1 L
 
A.2.2.1.3.1.2 Preparación.
A.2.2.1.3.1.2.1 Disolver a vapor fluyente para disolver los ingredientes, aforar a 1 L de agua y ajustar el pH a 7.6 ±0.1 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera. Esterilizar a 121 ±1°C en autoclave por 20 minutos.
A.2.2.1.3.1.2.2 Guardar en el refrigerador después de que solidifique.
 
A.2.2.1.3.1.2.3 Solución de sulfito de sodio (Na2S03).
A.2.2.1.3.1.2.3.1 Disolver 10 g de sulfito de sodio en 100 mL de agua.
A.2.2.1.3.1.2.3.2 Se recomienda preparar la solución cada dos semanas.
A.2.2.1.3.1.2.4 Solución de sulfato de Fierro (II) (FeSO4).
A.2.2.1.3.1.2.4.1 Disolver 8 g de sulfato de Fierro (II) cristalizado en 100 mL de agua.
A.2.2.1.3.1.2.5 Medio completo.
A.2.2.1.3.1.2.5.1 Inmediatamente antes de utilizarse, mezclar el medio base (véase A.2.2.1.3.1.1) por cada 18 mililitros adicionar 1 mL de la solución de sulfito de sodio (véase A.2.2.1.3.1.2.3) y cinco gotas de la solución de sulfato de Fierro (II) (véase A.2.2.1.3.1.2.4).
A.2.2.1.3.1.2.5.2 Adicionar 1 mililitro de la solución de sulfito de sodio y cinco gotas de la solución de sulfato de Fierro (II) a los tubos de agar antes de iniciar el análisis.
A.2.2.1.3.2 Agar sulfito-triptosa (medio alternativo).
Ingrediente.
Cantidad.
Triptosa.
15.0 g
Soytona.
5.0 g
Extracto de levadura.
5.0 g
Metabisulfito de sodio.
1.0 g
Citrato férrico (III) amoniacal.
1.0 g
Agua.
1 L
 
A.2.2.1.3.2.1 Preparación.
A.2.2.1.3.2.1.1 Calentar a vapor fluyente para disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7.6 ±0.1 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera.
A.2.2.1.3.2.1.2 Distribuir en volúmenes de 18 mL en tubos de ensaye. Esterilizar el medio por 15 min a 121 ±1°C.
A.2.2.1.3.2.1.3 Guardar en el refrigerador a 4°C a 5°C.
A.2.2.1.3.2.1.4 Descartar el medio que no se ha utilizado después de 2 semanas de su preparación.
A.2.2.1.4 Aparatos e instrumentos.
A.2.2.1.4.1 Jarras de anaerobiosis.
A.2.2.1.4.2 Olla de presión para generar vapor fluyente.
A.2.2.1.4.3 Baño de agua.
A.2.2.1.4.4 Equipo para filtración de membrana.
A.2.2.1.4.5 Incubadora que mantenga una temperatura de 37°C ±1.0°C.
A.2.2.1.5 Procedimiento.
A.2.2.1.5.1 Para la selección de esporas: Antes de iniciar la prueba, calentar la muestra en baño de agua a 75°C ±5.0°C por 15 min a partir de que se alcance la temperatura. Utilizar periódicamente un frasco similar que contenga el mismo volumen de agua que el de la muestra como control para confirmar que durante el tiempo de calentamiento requerido, la temperatura se mantenga monitoreando con un termómetro.
A.2.2.1.5.2 Inoculación e incubación.
A.2.2.1.5.2.1 Filtración e incubación.
A.2.2.1.5.2.2 Conectar el equipo de filtración a la bomba de vacío.
A.2.2.1.5.2.3 Utilizando pinzas estériles, colocar la membrana con la cuadrícula hacia arriba sobre el portafiltro.
 
A.2.2.1.5.2.4 Colocar cuidadosamente el embudo sobre el receptáculo y asegurarlo en su lugar.
A.2.2.1.5.2.6 Abrir la llave de paso y filtrar a través de la membrana, 100 mL de muestra aplicando suficiente vacío (aproximadamente 70 kPa). Cerrar la llave de paso tan pronto como la muestra haya sido filtrada. Es aconsejable enjuagar el embudo mediante la filtración de 1 a 3 porciones de 10 a 30 mL de diluyente estéril, mientras la membrana permanezca en su lugar. Inmediatamente después cerrar la llave de paso.
A.2.2.1.5.2.7 Retirar el embudo para dejar expuesta la membrana de filtración. Colocar la membrana con pinzas estériles en el agar Slanetz & Bartley. Evitar la formación de burbujas entre la membrana y la superficie del agar.
A.2.2.1.5.2.8 Incubar las placas invertidas a 36°C ±2°C durante 44 h ±4 h.
A.2.2.1.5.3 Confirmación y Recuento.
A.2.2.1.5.3.1 Las esporas de Clostridium sulfito reductores son elevadas, de color rojo, marrón o rosado.
A.2.2.1.5.3.2 Si hay colonias típicas, transferir la membrana con pinzas estériles a una placa con agar bilis esculina azida.
A.2.2.1.5.3.3 Incubar a 44°C ±0.5°C durante 2 h.
A.2.2.1.5.3.4 Leer la placa inmediatamente después de la incubación.
A.2.2.1.5.3.5 Las colonias típicas de esporas de Clostridium sulfito reductores presentan un color marrón a negro alrededor de la colonia.
A.2.2.1.5.3.6 Con ayuda de un cuenta colonias, seleccionar cajas que contengan entre 20 y 80 colonias típicas y contar el número de UFC.
NOTA: Una distribución desigual de las colonias o la presencia de flora competitiva, puede interferir con la diferenciación de colonias positivas debido a la difusión del color a las colonias adyacentes.
A.2.2.1.5.3.7 Filtrar 100 mL de agua con baja contaminación de esporas de Clostridium sulfito reductores.
A.2.2.1.5.3.8 Para agua altamente contaminada, usar volúmenes similares, pero filtrar en porciones de 10 mL que deben ser mezclada con 10 a 100 mL de agua estéril o diluyente.
A.2.2.1.5.3.9 Ajustar las diluciones de tal forma que las colonias negras resultantes estén bien separadas y puedan fácilmente contarse.
A.2.2.1.5.3.10 Después de la filtración, quitar la membrana con pinzas estériles y colocarla cuadrícula hacia arriba en el fondo de la caja Petri, asegurarse que no existan burbujas de aire atrapadas debajo de la membrana. Cuidadosamente vaciar 18 mL del medio de cultivo completo fundido, sobre la membrana, previamente mantenido a 50°C. Después de depositar el medio, incubar en condiciones de anaerobiosis o en otras condiciones que aseguren anaerobiosis a una temperatura de 37 ±1°C por 20 ±4 h y 44 ±4 h. Si se utiliza una jarra de anaerobiosis o una incubadora de anaerobiosis, el filtro de membrana deberá ser colocado sobre la superficie del agar.
A.2.2.1.5.4 Expresión de los resultados.
A.2.2.1.5.4.1 Cálculos.
A.2.2.1.5.4.1.1 Aplicar la siguiente fórmula para determinar la cantidad de esporas de Clostridium sulfito reductores:

En donde:
Cs, es el número estimado de UFC en un volumen de referencia de la muestra (100mL)
Z, es la suma de colonias contadas en las membranas provenientes de diferentes diluciones d1, d2,....di o de esos volúmenes separados de muestras filtradas.
Vs, es el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración en la muestra de esporas de Clostridium sulfito reductores.
Vtot, es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución.
O

 
En donde:
n1, n2,... ni, es el No. de membranas filtradas por dilución d1, d2, ....di
V1, V2, ....Vi, es el volumen analizado en la dilución d1, d2, ....di
d1, d2, ....di es la dilución utilizada por cada porción de volumen analizado V1, V2, ....Vi, ( d=1 para la muestra sin diluir, d=0.1 para la dilución 1:10, etc.).
Ejemplo.
Volumen probado.
Cuentas.
100 mL
82 colonias.
10 mL
11 colonias.
Sustitución

Y si Vs es 100 mL
A.2.2.1.5.5 Interpretación.
A.2.2.1.5.5.1 Contar todas las colonias negras después de incubar las placas por 20 ±4 h y 44 ±4 h.
A.2.2.1.5.6 Informe de prueba.
A.2.2.1.5.6.1 Informar como:
A.2.2.1.5.6.2 UFC de esporas de Clostridium sulfito reductores/100 mL.
A.2.2.1.5.6.3 Si se observan menos de 20 colonias aplicar la fórmula 4.1 e informar como valor estimado.
A.2.2.1.5.6.4 Placas sin colonias, informar como UFC de esporas de Clostridium sulfito reductores/100 mL e informar como valor estimado.
A.2.2.1.5.6.5 Donde: Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución (véase punto A.2.2.1.5.4.1.1)
A.2.2.1.5.6.6 También se puede informar como "Cero" u "organismos no detectables" indicando el volumen de muestra analizada.
A.2.2.1.5.6.7 En el informe de prueba debe establecerse el método empleado y expresar los resultados como UFC. El recuento a las 44 ±4 h de ser reportado normalmente. Si esto no fuera posible, el recuento de las 20 ±4 h deberá reportarse sólo como una aproximación UFC de esporas de Clostridium sulfito reductores /100 mL.
A.2.2.1.5.6.8 Además debe mencionarse cualquier modificación no especificada norma o mencionarse como opcional, junto con los detalles de cualquier incidente que pudiera influir en los resultados.
A.2.2.1.5.6.9 El informe de prueba debe incluir toda la información necesaria para la identificación plena de la muestra.
A.2.3 Método de prueba para la determinación Cuenta total de mesofílicos aerobios.
A.2.3.1 Fundamento.
La cuenta heterotrófica en placa, formalmente conocida como cuenta estándar, es un producto de la estimación del No. de bacterias heterotróficas vivas, cuyo objetivo es determinar la efectividad de tratamiento y distribución del agua o hielo. Las colonias de bacterias pueden estar formadas por células agrupadas en pares, cadenas, racimos o separadas; todas ellas se incluyen en el término UFC. Su cuenta final dependerá de la interacción entre los microorganismos, el medio de cultivo elegido y el tiempo de incubación. Los métodos más comunes son: Vaciado en placa, filtración por membrana y extensión en placa. Se deben aplicar y controlar las condiciones en que se llevan a cabo estos métodos.
La cuenta heterotrófica en placa, formalmente conocida como cuenta estándar o cuenta en placa, es un producto de la estimación del No. de bacterias heterotróficas vivas en agua o hielo.
El método de vaciado en placa es sencillo de realizar y utiliza volúmenes de muestra o sus diluciones en
un intervalo de 0.1 a 2.0 mL. Las colonias producidas son relativamente pequeñas y compactas, mostrando menos tendencia a encimarse unas a otras, que aquéllas producidas en extensión superficial. Por otro lado, las colonias inmersas tienen lento desarrollo y son difíciles de transferir, además están sometidas a un choque térmico producido cuando se vierte el medio de cultivo a una temperatura de 45°C a 46°C.
El método de filtración por membrana permite analizar mayores volúmenes de agua con escasa turbiedad y es el método de elección para aguas con cuentas entre 1 y 10 UFC/mL. En este método no existe un choque térmico, pero se agrega el costo de los filtros de membrana. Muchas desventajas incluyen: un área más pequeña de conteo, la necesidad de detectar colonias a través de luz reflejada contra un fondo blanco, daños a las células por una excesiva presión de filtración, así como posibles variaciones en la calidad de las membranas.
A.2.3.2 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.
A.2.3.2.1 Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.
A.2.3.2.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio deberá esterilizarse mediante horno, durante 2 h de 170°C a 175°C ó 1 h a 180°C o en autoclave, a 121 ±1.0°C durante 15 min como mínimo.
A.2.3.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios de cultivo.
A.2.3.2.4 El laboratorio debe tener claramente definido un sistema de control de calidad, para asegurar que los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.
A.2.3.2.5 Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con un pH de 5 a 7.
A.2.3.2.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
A.2.3.2.7 Evitar imprecisiones en los conteos debidos a descuido o fallas para reconocer colonias. La precisión del analista deberá estar dentro de un 5% y entre analistas 10%.
A.2.3.3 Aparatos e instrumentos.
A.2.3.3.1 Contador manual tipo Tally.
A.2.3.3.2 Contador de colonias Quebec o equivalente.
A.2.3.3.3 Incubadora que evite variaciones mayores a 0.5°C y termómetro calibrado y/o verificado.
A.2.3.3.4 Baño de agua a 45°C que evite variaciones mayores a 1°C.
A.2.3.3.5 Cajas de Petri de vidrio de borosilicato o desechables de 15 x 90 mm a 15 x 100 mm.
A.2.3.4 Medios de cultivo y reactivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.
A.2.3.4.1 Agar cuenta en placa (agar triptona extracto de levadura).
Ingrediente.
Cantidad (g).
Triptona.
5.0
Extracto de levadura.
2.5
Glucosa.
1.0
Agar.
15.0
 
A.2.3.4.1.1 Preparación.
A.2.3.4.1.2 Disolver los ingredientes en 1 L de agua, dejar reposar 15 min y calentar en baño de agua hasta disolución completa. Distribuir en frascos de acuerdo con el v requerido. Esterilizar a 121°C durante 15 min, ajustar el pH final 7.0 ±0.2 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera.
A.2.3.4.2 Solución amortiguadora de fosfatos (agua diluyente).
A.2.3.4.2.1 Solución madre.
A.2.3.4.2.1.1 Disolver 34.0 g de KH2PO4 en 500 mL de agua. Ajustar el pH 7.2 ±0.5 con disolución de hidróxido de sodio 0.1 N o una disolución de HCl 0.1 N según se requiera y diluir a 1 L con agua. Esterilizar a 121°C durante 15 min. Almacenar en refrigeración.
 
A.2.3.4.2.2 Solución de trabajo.
A.2.3.4.2.2.1 Agregar a 1 L de agua, 1.25 mL de la solución madre más 5.0 mL de solución de cloruro de magnesio (81.1 g de MgCl26H2O por 1 L de agua). Distribuir en frascos o tubos 99 ±2.0 mL o 9 ±0.2 mL. Esterilizar a 121°C durante 15 min.
A.2.3.5 Preparación de la muestra.
A.2.3.5.1 Seleccionar las diluciones apropiadas donde el No. de UFC está entre 30300.
A.2.3.5.2 Cuando se sospeche de una cuenta estándar mayor a 3000 UFC, preparar diluciones hasta 10-2 (1 mL de muestra + 99 mL de solución amortiguadora de fosfatos como diluyente) (véase el diagrama Preparación de las disoluciones.)
A.2.3.6 Recomendaciones generales previas al análisis de la muestra.
A.2.3.6.1 Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a ¾ de lleno, deberán agitarse 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 s, para asegurar una unidad analítica representativa.
A.2.3.6.2 Como alternativa al uso de campanas de fermentación (Durham) utilizar purpura de bromocresol a una concentración de 0.01 g/L al medio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de este indicador.
A.2.3.6.3 Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra.
A.2.3.7 Procedimiento.
A.2.3.7.1 Vaciado en placa.
A.2.3.7.1.1 Depositar en el centro de cada una de 2 cajas de Petri, una alícuota de 1 mL de la muestra directa o de su dilución.
A.2.3.7.1.2 Vaciar 1520 mL de agar triptona extracto de levadura, previamente fundido y mantenido a 45°C ±1°C. El tiempo transcurrido desde la preparación de la primera dilución y el vaciado del agar no debe exceder de 20 min.
A.2.3.7.1.3 Mezclar suavemente, en una superficie lisa, con 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en sentido opuesto y 6 de atrás hacia delante.
A.2.3.7.1.4 Preparar una caja testigo con medio de cultivo únicamente.
A.2.3.7.1.5 Dejar solidificar, incubar las cajas invertidas a 35°C ±0.5°C durante 48 h ±2 h.
A.2.3.7.1.6 Con la ayuda de un cuenta colonias contar, inmediatamente después de concluido el periodo de incubación, todas las colonias de las cajas de Petri elegidas que tengan entre 30300 UFC, incluir hasta las colonias puntiformes. Si las cuentas no caen dentro de este intervalo, seleccionar aquellas cajas que tengan cuentas lo más cercano a éste. Anotar el resultado en la bitácora correspondiente.
A.2.3.7.1.7 Anotar el control de esterilidad en la bitácora correspondiente.
Diagrama -Preparación de las diluciones.
 
A.2.3.8 Expresión de los resultados.
A.2.3.8.1 Cálculos.
A.2.3.8.1.1 Calcular el promedio de la cuenta (media aritmética) de los duplicados.
A.2.3.8.1.2 Cuando reporte los resultados, redondear las 2 primeras cifras significativas al momento de multiplicar por el inverso de la dilución. Redondear a la cifra más alta cuando el tercer dígito sea 6, 7, 8 o 9 y a la cifra más baja cuando el tercer dígito sea 1, 2, 3 ó 4. Cuando el tercer dígito sea 5 redondear hacia abajo cuando el segundo dígito sea menor a éste y redondear hacia arriba cuando el segundo dígito sea igual o mayor a 5 (por ejemplo 2 850 como 2 900).
A.2.3.8.1.3 En cuentas directas, para valores menores de 30 incluyendo el cero, reportar < 30 UFC de mesofílicos aerobios/mL, vaciado en placa, 35°C/48 h en agar cuenta estándar.
Ejemplo:
Cuenta calculada.
UFC
12 700
13 000
12 400.
12 000
15 500.
16 000
14 500.
14 000
 
 

En donde:
d es el factor de dilución en la cual se obtuvo el primer conteo.
 
Dilución 1:100
Dilución 1:1000
Resultado UFC/mL
Cuentas.
18
2
< 3,000
0
0
< 3,000
 
Placas con cuentas mayores a 300 UFC.
 
Dilución 1:100
Dilución 1:1000
UFC/mL
estimado
Cuentas.
Incontable.
640
640,000
 
 
Dilución 1:100
Dilución 1:1000
UFC/mL
Estimado.
Cuentas.
Incontable.
Incontable.
> 6,500 000 A
 
 
 
> 5,900 000 B
En donde:
A es considerando que el área de la placa es de 65 cm2;
B es considerando que el área de la placa es de 59 cm2;
 
Debido a la gran diversidad de productores de cajas de Petri, se sugiere recalcular el área de las placas mediante la siguiente:

En donde:
es 3.1416 y
r es el radio de la placa en cm.
A.2.3.9 Informe de prueba.
A.2.3.9.1 Informar como:
A.2.3.9.2 UFC mesofílicas aerobias/mL, vaciado en placa, 35°C/48 h en agar cuenta estándar.
A.2.4 Método de prueba para la determinación de Filtración por membrana.
A.2.4.1 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.
A.2.4.1.1 Trabajar en condiciones asépticas en área limpia y descontaminada.
A.2.4.1.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio deberá esterilizarse mediante horno, durante 2 h de 170°C a 175°C ó 1 h a 180°C o en autoclave, a 121 ±1.0°C durante 15 min como mínimo.
A.2.4.1.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios de cultivo.
A.2.4.1.4 El laboratorio debe tener claramente definido un sistema de control de calidad, para asegurar que los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.
A.2.4.1.5 Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con un pH de 5 a 7.
A.2.4.1.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
A.2.4.1.7 Evitar imprecisiones en los conteos debidos a descuido o fallas para reconocer colonias. La precisión del analista deberá estar dentro de un 5% y entre analistas 10%.