NORMA Oficial Mexicana NOM-243-SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.
MIGUEL
ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de
Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en el artículo 39 de la Ley
Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal de
Procedimiento Administrativo; 3 fracción XXIV, 13 apartado A fracciones I y II,
17 bis fracción III, 17 bis 2, 114, 115, fracción VII, 194 fracción I, 197,
199, 201, 205, 210, 212, 214, 215 fracción I, 216 de la Ley General de Salud; 3
fracción XI, 38 fracción II, 40 fracciones I, II y XI, 41, 43, 46, 47 fracción
IV de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 del Reglamento de la
Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 1 fracción I, 4, 8, 13, 15, 25,
30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 52, 53, 54, 55 y 56 del Reglamento de Control
Sanitario de Productos y Servicios; 2 inciso C fracción X del Reglamento
Interior de la Secretaría de Salud; 3 fracción I inciso C y fracción II y 10
fracciones IV y VIII del Reglamento de la Comisión Federal para la Protección
contra Riesgos Sanitarios, y
CONSIDERANDO
Que en
cumplimiento a lo previsto en el artículo 46 fracción I de la Ley Federal sobre
Metrología y Normalización, el Subcomité de Productos y Servicios presentó en
el año de 2005 al Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y
Fomento Sanitario, el anteproyecto de Norma Oficial Mexicana.
Que con
fecha 23 de junio de 2008, en cumplimiento del acuerdo del Comité y lo previsto
en el artículo 47 fracción I, de la Ley Federal sobre Metrología y
Normalización, se publicó el Proyecto de Norma Oficial Mexicana
PROY-NOM-243-SSA1-2005, PRODUCTOS Y SERVICIOS. LECHE, FORMULA LACTEA, PRODUCTO
LACTEO COMBINADO Y DERIVADOS LACTEOS. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES
SANITARIAS. METODOS DE PRUEBA en el Diario Oficial de la Federación, a efecto
que dentro los sesenta días naturales posteriores a dicha publicación, los
interesados presentaran sus comentarios al Comité Consultivo Nacional de
Normalización de Regulación y Fomento Sanitario.
Que con
fecha previa, fueron publicadas en el Diario Oficial de la Federación, las
respuestas a los comentarios recibidos por el mencionado Comité, en los
términos del artículo 47 fracción III de la Ley Federal sobre Metrología y
Normalización.
Que en
atención a las anteriores consideraciones, contando con la aprobación del
Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario,
he tenido a bien expedir y ordenar la publicación de la siguiente:
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-243-SSA1-2010. PRODUCTOS Y SERVICIOS. LECHE, FORMULA LACTEA, PRODUCTO LACTEO COMBINADO Y DERIVADOS LACTEOS. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES SANITARIAS. METODOS DE PRUEBA
PREFACIO
En la
elaboración de la presente Norma Oficial Mexicana participaron las siguientes
unidades administrativas, organismos e instituciones:
SECRETARIA
DE SALUD
Comisión
Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios
UNIVERSIDAD
NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
Programa
Universitario de Alimentos
INSTITUTO
POLITECNICO NACIONAL
Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas
LICONSA,
S.A. DE C.V.
CONSEJO
PARA EL FOMENTO DE LA CALIDAD DE LA LECHE Y SUS DERIVADOS A.C.
CAMARA
NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE TRANSFORMACION
CAMARA
NACIONAL DE INDUSTRIALES DE LA LECHE
ASOCIACION
DE GANADEROS PRODUCTORES DE LECHE PURA, S.A DE C.V.
DANONE
DE MEXICO, S.A. DE C.V.
GRUPO
CHEN
UNILEVER
DE MEXICO, S DE R.L. DE C.V.
INDICE
1. Objetivo
y Campo de Aplicación
2.
Referencias
3.
Definiciones
4.
Clasificación
5.
Símbolos y Abreviaturas
6. Especificaciones
sanitarias
7.
Muestreo
8.
Métodos de prueba
9.
Etiquetado
10.
Concordancia con normas internacionales
11.
Bibliografía
12. Observancia
de la norma
13.
Vigencia
Apéndice Normativo A. Límites máximos para
aditivos alimentarios.
Apéndice Normativo B. Métodos de Prueba
Apéndice Informativo A. Lista de sustancias
desinfectantes recomendadas
Apéndice Informativo B. Procedimiento de
limpieza y descontaminación del material de vidrio y área de trabajo para la
determinación de aflatoxinas.
1. Objetivo y Campo
de Aplicación
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece las especificaciones sanitarias y nutrimentales que debe cumplir la leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y los derivados lácteos.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que se dedican al proceso e importación de la leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados lácteos.
2. Referencias
Esta norma se complementa con las siguientes
o las que las sustituyan:
Norma Oficial Mexicana
NOM-051-SCFI/SSA1-2010 Especificaciones generales de etiquetado para
alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados - Información comercial y
sanitaria.
Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994
Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su
composición. Especificaciones nutrimentales.
Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009
Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios.
Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994
Salud Ambiental, agua para uso y consumo humano-Límites permisibles de calidad y
tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.
Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995
Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético y
sometidos a tratamiento térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.
3. Definiciones
Los términos en los que se
definen y clasifican los productos específicos no son denominaciones comerciales
y su aplicación se relaciona exclusivamente con el control sanitario.
Para efectos de esta Norma
Oficial Mexicana se entiende por.
3.1 Aditivo o Aditivo
para alimentos, cualquier
sustancia permitida que, sin tener propiedades nutritivas, se incluya en la
formulación de los productos y que actúe como estabilizante, conservador o
modificador de sus características organolépticas, para favorecer ya sea su
estabilidad, conservación, apariencia o aceptabilidad.
3.2
Alimento y bebida no alcohólicas con modificaciones en su composición, al
que ha sufrido cambios en su composición por adición, disminución o eliminación
de uno o más de sus nutrimentos, tales como hidratos de carbono, proteínas,
lípidos, vitaminas, minerales o fibra; y que forman parte de la dieta habitual.
3.3
Azúcares, a todos los mono y disacáridos presentes en un
alimento o bebida no alcohólica.
3.4 Bases o mezclas
para helados, es la emulsión cuya composición se ajusta al
helado, según sea el caso, pudiendo presentarse en forma líquida, concentrada o
en polvo.
3.5 Bitácora o
registro, al documento controlado que provee evidencia
objetiva y auditable de las actividades ejecutadas o resultados obtenidos
durante el proceso del producto y su análisis.
3.6 Buenas prácticas
de fabricación, en particular para el caso de los aditivos se
refiere a la cantidad mínima indispensable para lograr el efecto deseado.
3.7 Congelación, método
de conservación físico que se efectúa por medio de equipo especial para lograr
una reducción de la temperatura de los productos objeto de esta norma en su
centro térmico a máximo -18°C (255°K).
3.8 Consumidor,
persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final
productos alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados.
3.9 Contaminantes, entidades
físicas, químicas o biológicas indeseables, que se encuentran en el producto,
por arriba de los límites permisibles.
3.10 Crema, al
producto terminado en el que se ha reunido una fracción determinada de grasa y
sólidos no grasos de la leche, ya sea por reposo, por centrifugación o
reconstitución sometida a pasteurización y cualquier otro tratamiento térmico
que asegure su inocuidad.
3.11 Derivados o productos lácteos, productos
obtenidos a partir de la leche o sus componentes y otros ingredientes
funcionalmente necesarios para su elaboración, incluidos los productos con
grasa vegetal.
3.12 Deshidratación, al
tratamiento que consiste en la eliminación de agua de un producto.
3.13 Dulces a base de
leche, a los productos elaborados por tratamiento térmico de la leche y
edulcorantes, pudiendo ser adicionados de aditivos e ingredientes opcionales.
3.14
Edulcorante, sustancia que produce la sensación de
dulzura, de orígenes naturales o sintéticos.
3.15 Envasado aséptico,
al proceso que reúne las condiciones de esterilidad comercial para
evitar la presencia de microorganismos en el producto durante el envasado.
3.16 Envase, cualquier
recipiente, o envoltura en el cual está contenido el producto preenvasado para
su venta al consumidor.
3.17 Esterilización
comercial, al tratamiento térmico aplicado al producto para la
destrucción de todos los microorganismos viables de importancia en la salud
pública y aquellos capaces de reproducirse en el alimento bajo condiciones
normales de almacenamiento y distribución, sin la condición de refrigeración.
3.18 Etiqueta,
marbete rótulo, inscripción, marca, imagen gráfica u otra forma descriptiva,
que se haya escrito, impreso, estarcido, marcado, en relieve o en hueco,
grabado, adherido, precintado o anexado al empaque o envase del producto.
3.19 Fecha de
caducidad, a la fecha límite en que se considera que un
producto preenvasado almacenado en las condiciones establecidas por el
fabricante, mantiene las características sanitarias que debe reunir para su
consumo. Después de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.
3.20 Fecha de consumo
preferente, fecha en que, bajo determinadas condiciones de
almacenamiento, expira el periodo durante el cual el producto preenvasado es
comercializable y mantiene las cualidades específicas se le atribuyen tácita o
explícitamente, pero después de la cual el producto preenvasado puede ser
consumido.
3.21 Fórmula láctea, es el
producto elaborado a partir de ingredientes propios de la leche, tales como
caseína, grasa, lactosueros y agua para consumo humano. En cantidades de
conformidad con lo que establece la norma de denominación comercial
correspondiente.
3.22 Función
tecnológica, efecto que produce el uso de aditivos en los
alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados, que proporciona o intensifica
su aroma, color o sabor, y/o mejora su estabilidad y conservación, entre otros.
Véase aditivo.
3.23 Helado,
alimento producido mediante la congelación con o sin agitación de una mezcla
pasteurizada compuesta por una combinación de ingredientes lácteos pudiendo
contener grasas vegetales, frutas, huevo y sus derivados, saborizantes,
edulcorantes y otros aditivos; cuando está empalillado se nombrará paleta.
3.24 Información
nutrimental, toda descripción destinada a informar al consumidor
sobre las propiedades nutrimentales de un alimento o bebida no alcohólica
preenvasado. Comprende dos aspectos:
a) La declaración nutrimental obligatoria.
b) La
declaración nutrimental complementaria.
3.25 Ingrediente, cualquier sustancia o producto, incluidos los aditivos, que se
emplee, en la fabricación o preparación de un alimento o bebida no alcohólica y
esté presente en el producto final, transformado o no.
3.26 Ingredientes
opcionales, a los que se pueden adicionar a los productos tales
como: chiles, condimentos, especias, frutas,
verduras, entre otros.
3.27 Leche, a la
secreción natural de las glándulas mamarias de las vacas sanas o de cualquier
otra especie animal, excluido el calostro.
3.28
Leche acidificada, a la obtenida por la acidificación de la leche
entera, parcialmente descremada o descremada, pasteurizada, con agentes
acidulantes.
3.29 Leche condensada
azucarada, la que ha sido obtenida mediante la evaporación
del agua de la leche a través de presión reducida, a la que se le ha agregado
sacarosa y/o dextrosa u otro edulcorante natural, hasta alcanzar una
determinada concentración de grasa butírica y sólidos totales.
3.30 Leche evaporada,
producto obtenido mediante eliminación parcial del agua de la leche por el
calor o por cualquier otro procedimiento que permita obtener un producto con la
misma composición y características de la leche sin modificación en la
proporción entre la caseína y la proteína de la leche.
3.31 Leche fermentada, a la
obtenida por la acidificación de la leche estandarizada entera o deshidratada,
pasteurizada, parcialmente descremada, semidescremada o descremada, debido a la
acción de bacterias lácticas vivas con la consiguiente reducción del pH,
adicionada o no por aditivos, por alimentos e ingredientes opcionales.
3.32 Límite máximo,
cantidad establecida de aditivos, microorganismos, parásitos, materia extraña,
plaguicidas, metales pesados y metaloides, entre otros, que no se debe exceder
en un alimento, bebida o materia prima.
3.33 Limpieza,
conjunto de procedimientos que tiene por objeto eliminar tierra, residuos,
suciedad, polvo, grasa u otras sustancias objetables.
3.34 Lote, a la
cantidad de un producto, elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades
homogéneas.
3.35 Mantequilla, al
producto obtenido a partir de la grasa de la leche o grasa de la crema, la cual
ha sido pasteurizada, sometida a maduración, fermentación o acidificación,
batido o amasado, pudiendo ser o no adicionada de sal. El contenido de grasa
butírica debe ser mínimo de 80%.
3.36 Materia extraña, a
cualquier sustancia, resto, desecho o material que se presenta en el producto
pero que no forma parte de la composición normal de éste.
3.37 Metal pesado, a los
elementos químicos que causan efectos indeseables en el metabolismo aun en
concentraciones bajas. Su toxicidad depende de la dosis en que se ingieran, así
como su acumulación en el organismo.
3.38 Método de prueba, al procedimiento analítico utilizado para comprobar que un
producto satisface las especificaciones que establece la norma.
3.39 Muestra, al total de unidades
de producto provenientes de un lote y que representan las características y
condiciones del mismo.
3.40 Pasteurización, al tratamiento
térmico al que se someten los productos, consistente en una relación de
temperatura y tiempo que garantice la destrucción de organismos patógenos y la
inactivación de algunas enzimas de los alimentos.
3.41 Planta procesadora, al
establecimiento dedicado al proceso de pasteurización, ultrapasteurización,
esterilización, deshidratación, rehidratación, entre otros procesos de la
leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado.
3.42 Proceso, al conjunto de
actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación, preparación,
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte,
distribución, almacenamiento y expendio o suministro al público de los
productos objeto de esta norma.
3.43 Producto a granel, al
producto que debe pesarse, medirse, o contarse en presencia del consumidor por
no encontrarse preenvasado al momento de su venta.
3.44 Producto lácteo combinado, el
producto elaborado a partir de sólidos lácteos u otros ingredientes que no
proceden de la leche. En cantidades de conformidad con lo que establece la
norma de denominación comercial correspondiente.
3.45 Prueba de esterilidad comercial, a la
retención temporal de las muestras representativas de los productos bajo
condiciones de tiempo y temperatura establecidas para verificar la esterilidad
comercial del producto.
3.46 Quesos, productos
elaborados de la cuajada de leche estandarizada y pasteurizada de vaca o de
otras especies animales, con o sin adición de crema, obtenida de la coagulación
de la caseína con cuajo, gérmenes lácticos, enzimas apropiadas, ácidos
orgánicos comestibles y con o sin tratamiento ulterior, por calentamiento, drenada,
prensada o no, con o sin adición de fermentos de maduración, mohos especiales,
sales fundentes e ingredientes comestibles opcionales, dando lugar a las
diferentes variedades de quesos pudiendo por su proceso ser: fresco, madurado o
procesado.
3.47 Quesos frescos, aquellos que
además de cumplir con la descripción general de queso se caracterizan por su
alto contenido de humedad, y por no tener corteza o tener corteza muy fina,
pudiendo o no adicionarles aditivos e ingredientes opcionales.
3.48 Quesos madurados, aquellos que
además de cumplir con la descripción general de queso, se caracterizan por ser
de pasta dura, semidura o blanda y pueden tener o no corteza; sometidos a un
proceso de maduración mediante adición de microorganismos, bajo condiciones
controladas de tiempo, temperatura y humedad, para provocar en ellos cambios
bioquímicos y físicos característicos del producto del que se trate, lo que le
permite prolongar su vida de anaquel, los cuales pueden o no requerir
condiciones de refrigeración.
3.49 Quesos procesados,
aquellos que además de cumplir con la descripción general de queso se
caracterizan por ser elaborados con mezclas de quesos, fusión y emulsión con
sales fundentes, aditivos para alimentos permitidos e ingredientes opcionales,
sometidos a proceso térmico de 70°C durante 30 segundos o someterse a cualquier
otra combinación equivalente o mayor de tiempo y temperatura, lo que le permite
prolongar su vida de anaquel.
3.50 Quesos de suero, productos
obtenidos a partir del suero de leche entera, semidescremada, o descremada
pasteurizada de vaca, cabra u oveja, el cual es coagulado por calentamiento en
medio ácido para favorecer la obtención de la cuajada, la que es salada,
drenada, moldeada, empacada y etiquetada y posteriormente refrigerada para su
conservación.
3.51 Refrigeración, al método de
conservación físico con el cual se mantienen los productos a una temperatura
máxima de 7°C (280°K) que se emplea para inhibir el desarrollo de la mayoría de
los microorganismos, reducir las reacciones bioquímicas y el deterioro propio
de los alimentos.
3.52 Rehidratación, al procedimiento
mediante el cual se restituye el agua a los productos deshidratados objeto de
esta norma.
3.53 Sorbete,
producto que cumple con la definición de helado, excepto en que su contenido de
grasa, sólidos no grasos y sólidos totales, son inferiores a los del helado.
3.54 Suero de leche,
líquido obtenido de la coagulación de la caseína de la leche, mediante la
acción de enzimas coagulantes de origen animal, vegetal o microbiano, por la
adición de ácidos orgánicos o minerales de grado alimentario; acidificación por
intercambio iónico hasta alcanzar el punto isoeléctrico de la caseína.
3.55 Tratamiento
térmico, al método físico que consiste en someter a una
fuente de calor suficiente por un tiempo apropiado al producto, antes o después
de ser envasado con el fin de lograr una estabilidad biológica y que garantice
la eliminación de microorganismos patógenos.
3.56 Ultrapasteurización,
al proceso al cual es sometido el producto a una adecuada relación de
temperatura y tiempo, envasado asépticamente para garantizar la esterilidad
comercial.
4. Clasificación
Los productos objeto de esta
norma por su proceso se clasifican de la siguiente manera, la cual
no corresponde a una denominación:
4.1 Leche
4.1.1 Pasteurizada
4.1.2 Ultrapasteurizada
4.1.3 Esterilizada
4.1.4 Deshidratada
4.2 Fórmula láctea
4.2.1 Pasteurizada
4.2.2 Ultrapasteurizada
4.2.3 Esterilizada
4.2.4 Deshidratada
4.3 Producto lácteo combinado
4.3.1 Pasteurizado
4.3.2 Ultrapasteurizado
4.3.3 Esterilizado
4.3.4 Deshidratado
4.4 Quesos
4.4.1 Frescos
4.4.1.1 Frescales: Panela, Canasto,
Sierra, Ranchero, Fresco, Blanco, Enchilado, Adobado.
4.4.1.2 De pasta cocida: Oaxaca,
Asadero, Mozzarela, Del Morral, Adobera.
4.4.1.3 Acidificados: Cottage, Crema,
Doble crema, Petit Suisse, Nuefchatel.
4.4.1.4 Quesos de suero:
Broccio, Broccotle, Cerrase, Geitmysost, Gyetost, Mejetle, Mysost, Recuit,
Requesón, Ricotta, Picotón, Schottenezinger, Zinder.
4.4.2 Madurados
4.4.2.1 Madurados prensados de pasta
dura: Añejo, Parmesano, Cotija, Reggianito.
4.4.2.2 Madurados prensados: Cheddar,
Chester, Chihuahua, Manchego, Brick, Edam, Gouda, Gruyere, Emmental, Cheshire,
Holandés, Amsterdam, Butterkase, Coulomiers, Dambo, Erom, Friese, Fynbo,
Havarti, Harzer-Kase, Herrgardsost, Huskallsost, Leidse, Maribo, Norvergia,
Provolone, Port Salut, Romadur, Saint Paulin, Samsoe, Svecia, Tilsiter, Bola,
Jack.
4.4.2.3 De maduración con mohos: Azul,
Cabrales, Camembert, Roquefort, Danablu, Limburgo, Brie.
4.4.3 Procesados
4.4.3.1 Fundidos
4.4.3.2 Fundidos para untar
4.4.4 Otros
quesos: frescos, madurados y procesados no considerados en los numerales 4.4.1,
4.4.2 y 4.4.3, deberán observar lo dispuesto en este ordenamiento.
4.5 Mantequilla
4.6 Cremas
4.6.1 Pasteurizadas
4.6.2 Ultrapasteurizadas
4.6.3 Esterilizadas
4.6.4 Deshidratadas
4.6.5 Acidificadas
4.6.6 Fermentadas
4.6.7 Batidas y para batir
4.7 Leche condensada azucarada
4.8 Leche fermentada o acidificada
4.9 Dulces a base de leche
4.9.1 Dulces de baja humedad (menos del 12%) o
endurecidos: caramelos, chiclosos, jamoncillos, etc.
4.9.2 Dulces de humedad intermedia (12-20%) que se
procesan mediante evaporación: glorias, cajeta y obleas con cajeta, etc.
4.9.3 Dulces
de alta humedad (más de 20%), procesados por coagulación, aireación y procesos
enzimáticos: flanes, gelatinas, chongos, mousse, arroz con leche, etc.
4.10 Helados
y Sorbetes
4.10.1 Helados
de crema
4.10.2 Helados
de leche
4.10.3 Helados
de grasa vegetal
4.10.4 Sorbetes
4.10.5 Bases
para helados y sorbetes
4.11 Otros
productos lácteos no considerados, deberán observar
lo dispuesto en este ordenamiento.
5. Símbolos
y Abreviaturas
|
AFM1 |
aflatoxina M1 |
|
BPF |
buenas prácticas
de fabricación |
|
cm |
centímetro |
|
cm2 |
centímetro
cuadrado |
|
ci |
color
index |
|
conc. HACCP |
concentración análisis
de peligros y de puntos críticos de control (por su siglas en inglés). |
|
HPLC |
cromatografía
de líquidos de alta eficacia |
|
ºC |
grados
Celsius |
|
g |
gramo |
|
x g |
gravedad
(en centrifugado) |
|
h |
hora |
|
= |
igual |
|
1/d |
inversa
de la dilución |
|
kg |
kilogramo |
|
lb |
libra |
|
L |
litro |
|
+ |
más |
|
m |
masa |
|
± |
más-menos |
|
Máx. |
máximo |
|
> |
mayor
que |
|
< < |
menor
que igual
o menor que |
|
m |
micra |
|
µg |
microgramo |
|
µL |
microlitro |
|
mg |
miligramo |
|
µm |
micrómetro |
|
mL |
mililitro |
|
min |
minutos |
|
mm |
milímetro |
|
mM |
milimolar |
|
M |
molar |
|
m/v |
masa
a volumen |
|
ng |
nanogramo |
|
nm |
nanómetro |
|
N |
normal |
|
No. |
número |
|
/ |
por |
|
% |
por ciento |
|
pH |
potencial
de hidrógeno |
|
Pulg |
pulgada |
|
rpm |
revoluciones
por minuto |
|
seg |
segundos |
|
x |
signo
de multiplicación |
|
UF |
unidades
de fenol |
|
UFC |
unidades
formadoras de colonias |
|
UI |
unidades
internacionales |
|
UV |
ultravioleta |
|
v |
volumen |
|
v/v |
volumen
a volumen |
Cuando en la presente norma se mencione:
·
Acuerdo, debe entenderse que se trata del Acuerdo
por el que se determinan las sustancias permitidas como aditivos y coadyuvantes
en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, y sus modificaciones.
·
Reglamento, debe entenderse que se trata del
Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.
6. Especificaciones
sanitarias
6.1 Generales
Los productos objeto de esta norma, además
de cumplir con lo establecido en el Reglamento, deben ajustarse a las
siguientes disposiciones:
6.1.1 Los
establecimientos que se dediquen al proceso e importación de los productos
comercializados en el Territorio Nacional objeto de esta norma, deben cumplir
con lo establecido en la NOM-251-SSA1-2009, señalada en el apartado de
referencias.
6.1.2 Todos
los ingredientes que se utilicen para la elaboración de los productos objeto de
esta norma, deben cumplir con las especificaciones sanitarias establecidas en
el Reglamento y las normas oficiales mexicanas correspondientes.
6.1.3 Los
productos que se modifiquen en su composición, deben cumplir con lo establecido
en la NOM-086-SSA1-1994, señalada en el
apartado de referencias.
6.1.4 Los
productos sujetos a tratamiento térmico y envasados en recipientes de cierre
hermético, además de cumplir con lo establecido en este ordenamiento, deben
cumplir con la NOM-130-SSA1-1995, señalada en el apartado de referencias.
6.1.5 La
leche, que se comercialice para su consumo humano o que se emplee como materia
prima para la elaboración de productos lácteos debe cumplir con lo siguiente:
6.1.5.1
No presentar materias extrañas, conservadores ni sustancias
neutralizantes.
6.1.5.2
No coagular por ebullición.
6.1.5.3
Presentar prueba de alcohol al 68% negativa (sólo para leche de bovino).
6.1.5.4
Presentar prueba de inhibidores bacterianos, negativa; detectados por
métodos fisicoquímicos y microbiológicos, de conformidad con la tabla 1 del
presente ordenamiento.
Tabla 1.
Inhibidores bacterianos en leche.
|
PRODUCTO |
Derivados Clorados |
Sales cuaternarias de amonio |
Oxidantes |
Formaldehído |
Antibióticos |
|
Pasteurizados |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
|
Ultrapasteurizados |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
|
0Esterilizados |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
Negativo |
6.1.5.5
Debe someterse a un tratamiento térmico con un tiempo y temperatura
determinados que garantice su inocuidad, independientemente del uso que se le
dé posteriormente. A excepción de la leche que se utilice para la elaboración
de quesos que por las características de éstos no pueda ser sometida a
tratamiento térmico, la cual debe cumplir con lo siguiente:
6.1.5.5.1
Tener implementado un sistema HACCP para su proceso, conforme a lo
establecido en el Apéndice A de la NOM-251-SSA1-2009, citada en el apartado de
referencias.
6.1.5.6
Los tratamientos térmicos a los que se someta la leche, fórmula láctea o
producto lácteo combinado para su comercialización, o antes de su uso como
materia prima para el caso de la leche, pueden ser: ebullición, pasteurización,
ultrapasteurización, esterilización o deshidratación.
Tabla 2.
Temperaturas y tiempos para tratamiento térmico de la leche, fórmula láctea o
producto combinado.
|
Tratamiento |
Temperatura y tiempo* |
|
Pasteurización |
Lenta
63°C / 30 min. Rápida
72°C / 15 seg. |
|
Ultrapasteurización
o esterilización |
135°C
a 149°C / 2 a 8 seg. |
* Puede emplearse alguna otra relación de
tiempo-temperatura que sea equivalente para la destrucción de los
microorganismos patógenos.
6.1.5.7
El equipo para la pasteurización lenta debe contar, por lo menos, con un
sistema para registro gráfico o numérico y control de la temperatura y tiempo
del proceso, tina con tapa y sistema de agitación del producto, termómetro de
mercurio con vástago de acero inoxidable funcionando y calibrado, o su
equivalente.
6.1.5.8
El equipo empleado para la pasteurización rápida debe contar, por lo
menos, con un sistema de control y registro automático de la temperatura y
tiempo del proceso, que no permita el paso del producto cuando no se haya
alcanzado la temperatura mínima establecida, así mismo, un sistema en que el
flujo del producto cumpla con el tiempo mínimo determinado. Termómetro de
mercurio o su equivalente funcionando y calibrado, colocado al final de la "zona
de sostenimiento" del equipo, en el que la terminal tenga contacto con el
producto.
6.1.5.8.1 La
temperatura registrada en el sistema de control y registro del proceso debe ser
< 1 °C de la temperatura que indique dicho termómetro.
6.1.5.9
El equipo empleado para la ultrapasteurización o esterilización, debe
contar con dispositivos de control y registro de temperatura de operación
durante el tiempo de producción, que permita comprobar que los productos han
sido sometidos al tratamiento térmico establecido.
6.1.5.10
Una vez alcanzada la temperatura, la leche, fórmula láctea o producto
combinado debe enfriarse rápidamente a una temperatura de 6°C, y manejarse a
esta temperatura hasta el momento del envasado a excepción de productos
ultrapasteurizados o esterilizados.
6.1.5.11
Los productos sometidos a deshidratación deben cumplir con lo siguiente:
a) Los que se utilicen como materia prima, deben ser pasteurizados previamente a la deshidratación.
b) No se podrán vender a granel al consumidor.
6.1.5.12
Los productos sometidos a rehidratación deben ser pasteurizados,
ultrapasteurizados o esterilizados, conforme a este ordenamiento.
6.1.6 Especificaciones físicas y químicas
6.1.6.1 Prueba de fosfatasa residual.
Tabla No. 3. Límite
máximo de fosfatasa residual.
|
Producto |
Límite máximo de fosfatasa residual (UF/g) |
|
Leche, fórmula
láctea o producto lácteo combinado pasteurizado* |
4 |
|
Quesos frescos,
madurados y procesados |
12 |
|
Quesos de suero |
4 |
|
Helados de
crema, de leche o grasa vegetal, sorbetes y bases o mezclas para helados |
4 |
|
Mantequilla y
cremas pasteurizada** |
4 |
Nota: Se
debe considerar que podrán presentar falsos positivos, por lo que esta prueba
no puede ser concluyente.
* No aplica para este tipo de productos
ultrapasteurizados, esterilizados y deshidratados.
** No aplica para leche condensada
azucarada, leche fermentada o acidificada y dulces a base de leche
6.1.6.2 No deben contener materia extraña.
6.1.7 Especificaciones de contaminantes
6.1.7.1 La presencia de contaminantes en los productos
objeto de esta norma no debe rebasar el límite máximo señalado en la siguiente
tabla.
Tabla No. 4.
Límites máximos de contaminantes(1)
|
Contaminante |
Límite máximo mg/kg |
|
Arsénico(2) |
0,2 |
|
Plomo |
0,1(3) 0,5(4) |
|
Mercurio |
0,05(3) |
|
Estaño |
250(5) |
|
Aflatoxina M1 |
0,5mg/L(3) |
(1) No aplica ningún contaminante
a los helados, sorbetes y bases o mezclas para helados; (2)
No aplica a mantequillas, cremas, leche fermentada y acidificada, leche
condensada azucarada, dulces a base de leche; (3) Límite
sólo para leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado, (4)
Límite para quesos (5) Aplica sólo para aquellos
productos envasados en hoja de lata sin barniz.
6.1.7.2 El productor o fabricante de los productos objeto
de esta norma, debe establecer mecanismos de control que permitan determinar la
presencia y cantidad de metales pesados y metaloides en las materias primas o
en el producto en proceso de elaboración o en el producto terminado. Es
recomendable establecer una periodicidad de verificación de mecanismos de
control de al menos 1 vez por año, considerando las condiciones del proceso e
instalaciones. La información generada debe
estar a disposición de la Secretaría de Salud, cuando ésta así lo requiera.
6.1.8 Especificaciones Microbiológicas
6.1.8.1 Los productos objeto de esta norma no deben exceder
los límites de microorganismos señalados a continuación:
Tabla 5.
Límites máximos de contenido microbiano para leche y derivados lácteos.
|
Microorganismo |
Límite máximo |
Productos |
|
Organismos Coliformes
totales |
<100 UFC/g o mL |
Helados y sorbetes. Quesos
de suero |
|
<50 UFC/g o mL |
Bases o mezclas para
helados. |
|
|
<20 UFC/g o mL |
En punto de venta: Leche,
fórmula láctea, producto lácteo combinado; pasteurizados. |
|
|
<10 UFC/g o mL |
En planta: Leche, fórmula
láctea, producto lácteo combinado; pasteurizados o deshidratados. Mantequilla, cremas, leche
condensada azucarada, leche fermentada o acidificada, dulces a base de leche. |
|
|
Staphylococcus aureus |
<10 UFC/ mL por siembra directa |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado pasteurizado. |
|
<100 UFC/g o mL |
Mantequilla, cremas, leche
condensada azucarada, leche fermentada o acidificada, dulces a base de leche. Quesos madurados y quesos
procesados |
|
|
1000 UFC/g |
Quesos frescos y quesos de
suero |
|
|
Salmonella spp |
Ausente en 25g o mL |
Leche, fórmula láctea,
producto lácteo combinado: pasteurizados y deshidratados. Quesos frescos, madurados
y procesados. Quesos de suero. Cremas, leche fermentada o
acidificada, dulces a base de leche*, helados, sorbetes y bases para helados. Mantequillas. |
|
Escherichia coli |
100 UFC/g o mL |
Quesos frescos. |
|
< 3 NMP/g o mL |
Leche utilizada como
materia prima para la elaboración de quesos. Leche, fórmula láctea,
producto lácteo combinado; deshidratados. |
|
|
< 10 NMP/g |
Quesos madurados y
procesados. |
|
|
Listeria monocytogenes |
Ausente en 25g o mL |
Leche, fórmula láctea,
producto lácteo combinado; pasteurizados ** Quesos. Quesos de suero. Helados, bases para
helados y sorbetes.**. |
|
Vibrio cholerae *** |
Ausente en 25g |
Quesos frescos. Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
Ausente en 50g |
Quesos de suero. |
|
|
Enterotoxina
estafilococcica |
Negativa |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado; deshidratados y la que se emplee como materia
prima para elaboración de quesos. Quesos frescos, madurados
y procesados. Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
Toxina
botulínica** |
Negativa |
Quesos frescos, madurados
y procesados, envasados al alto vacío. |
|
Mohos
y levaduras |
500 UFC/g o mL |
Quesos frescos,
madurados*** y quesos de suero. |
|
100 UFC/g o mL |
Quesos procesados. |
|
|
50 UFC/g o mL |
Bases o mezclas para helados. |
|
|
Mesofílicos
aerobios |
200,000 UFC/g o mL |
Helados y sorbetes. |
|
100,000 UFC/g o mL |
Bases para helado. |
* Para aquellos que contienen chocolate, cocoa,
coco, huevo y semillas.
** Se determinará únicamente en situaciones de
emergencia sanitaria, cuando la SSA de acuerdo a los resultados microbiológicos
detecte su presencia, y ordenará la realización de un plan de trabajo por parte
del fabricante o importador para controlar la presencia.
*** Aquellos productos que para su maduración
requieren de hongos, pudieran estar fuera de este límite.
6.1.9 Aditivos
6.1.9.1 Unicamente
se permiten los aditivos en los límites y productos que se señalan en el
apéndice normativo A de este ordenamiento.
6.1.10 Control
documental del proceso:
6.1.10.1 Los registros de
tratamiento térmico deben ser continuos y contar con la siguiente información:
Tabla 6. Información mínima
de los procedimientos, bitácoras o registros de las diferentes etapas del proceso.
|
DOCUMENTO |
INFORMACION |
|
Bitácora
o registro de Proceso |
- Control de tratamiento térmico. ·
Gráficas de temperatura y tiempo de tratamiento térmico
(pasteurización, ultrapasteurización o esterilización, deshidratación), por
equipo. ·
Temperatura y tiempo de enfriamiento. ·
Cantidad e identificación del producto - Registro de los hechos no comunes. |
|
Procedimiento de operaciones de
limpieza y desinfección de equipos para tratamiento térmico. |
- Personal encargado de la operación. - Frecuencia - Vigencia. |
|
Bitácora o Registro de
operaciones de limpieza y desinfección de equipo para tratamiento térmico. |
- Registro de los hechos no
comunes. |
|
Diagrama de proceso |
- Etapas de proceso con tiempos y
temperaturas de cada operación. |
6.2 Específicas
Además
de las especificaciones sanitarias generales señaladas en el numeral 6.1 de
este ordenamiento; se debe cumplir con lo siguiente:
6.2.1 Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado.
6.2.1.1 Deben
contener de 310 a 670 mg
equivalentes de retinol/L (1033 a 2233 UI/L), de forma natural o por
restauración. Y entre 5 a 7,5 mg/L de
Vitamina D3
(200-300 UI/L).
6.2.1.2 Los productos
adicionados con Vitamina A o D3 no deben contener cantidades superiores a las establecidas en este
ordenamiento.
6.2.1.3 Los productos
deshidratados deben contener una humedad no mayor al 4%.
6.2.1.4 Los productos
sometidos a ultrapasteurización o esterilización deben cumplir con lo
siguiente:
6.2.1.4.1 Ser envasados
asépticamente en envases que cuenten con barreras para proteger el producto del
oxígeno y la luz, y llenarse en ausencia de aire.
6.2.1.4.2 El cierre de los
envases debe ser hermético y llevar a cabo las pruebas para su control y los
registros correspondientes.
6.2.1.4.3 El envase que se
emplee, debe someterse a un tratamiento de desinfección.
6.2.1.4.4 Los agentes
desinfectantes deben tener actividad esporicida, no degradar el material del
envase, se deben evaporar fácilmente de la superficie del envase y no deben
reaccionar con el producto.
6.2.1.4.5 Sólo se permite el
uso de peróxido de hidrógeno para efectos de desinfección de los envases, éste
debe emplearse en una concentración de 30 al 50%.
6.2.1.4.6 Los
establecimientos deben destinar un área de incubación para la prueba de
esterilidad comercial para efectos del control interno de una muestra
representativa de la producción, de la cual se debe tomar una submuestra para
someterse a análisis microbiológicos.
6.2.2 Cremas
6.2.2.1 Las cremas
acidificadas y fermentadas deben tener una acidez titulable de no menos de 0,5%
expresada como ácido láctico.
6.2.2.2 Las
cremas deshidratadas deben contener una humedad no mayor al 4%.
6.2.3 Leche fermentada o
acidificada.
6.2.3.1 Las leches
fermentadas o acidificadas deben tener una acidez titulable de no menos de 0,5%
expresada como ácido láctico y su pH debe ser máximo de 4,5.
6.2.4 Helados, bases
para helados y sorbetes
6.2.4.1 Para la
elaboración de helados y sorbetes se permite la incorporación de aire limpio
como coadyuvante en su elaboración.
6.2.4.2 No se permite
volver a congelar los productos después de haber sido descongelados.
6.2.4.3 La mezcla para elaborar
los helados, bases para helados y sorbetes debe pasteurizarse de la siguiente
forma:
6.2.4.3.1 Deben someterse a
una temperatura de 68,5ºC durante un tiempo de 30 minutos, o.
6.2.4.3.2 Serán sometidas a
una temperatura de 79,4ºC durante un tiempo mínimo de 25 segundos, o
6.2.4.3.3 Someterlas a otra
relación de tiempos y temperaturas cuyo efecto sea el mismo.
6.2.4.3.4 En cualquiera de
los casos, una vez alcanzados, respectivamente, las temperaturas y tiempos
señalados se enfriará bruscamente a 4ºC.
6.2.4.3.5 Una vez
pasteurizadas las mezclas, deben mantenerse a una temperatura máxima de 6ºC
antes de someterse a congelación.
7. Muestreo
7.1 El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta
norma, debe sujetarse a lo que establece la Ley General de Salud, debiendo
mantener la muestra en condiciones que eviten su contaminación o
descomposición.
8. Métodos de Prueba
Para la
verificación oficial de las especificaciones que se establecen en esta norma,
se deben aplicar los métodos de prueba señalados en el apéndice normativo B de
este ordenamiento.
9. Etiquetado
La
etiqueta de los productos objeto de esta norma, además de cumplir con lo
establecido en el Reglamento y la NOM-051-SCFI/SSA1-2010 señalada en el
apartado de referencias, debe sujetarse a lo siguiente, sin interferir con las
atribuciones de otras dependencias:
9.1 En la superficie
principal de exhibición de los envases de leche, fórmula láctea y producto
lácteo combinado, debe declararse el tratamiento térmico al que fue sometido,
así como otros tratamientos aplicados para asegurar la inocuidad del producto,
establecidos en otros ordenamientos legales correspondientes.
9.2 En los
productos objeto de esta norma que contienen sal yodada, debe declararse como
tal en la lista de ingredientes.
9.3 Cuando
en la elaboración de los productos objeto de esta norma, se emplee leche que no
procede de vaca, se debe indicar su origen.
9.4 Los
quesos deben indicar el contenido de grasa butírica.
9.5 Los
productos objeto de esta norma a excepción de los helados, bases para helados y
sorbetes deben indicar "fecha de caducidad".
9.6 Si la
identificación del lote corresponde a la fecha de caducidad, se deben indicar las leyendas: "Lote"
y "Fecha de caducidad" o sus abreviaturas o sus equivalentes.
9.7 En la etiqueta
de productos pasteurizados y de aquellos que requieren refrigeración para su
conservación, se debe incluir la siguiente leyenda: "Manténgase en
refrigeración" o "Consérvese en refrigeración" o cualquier otra
equivalente.
9.8 En el
caso de los helados, sorbetes y otros productos que requieren congelación debe
figurar la leyenda "Manténgase en congelación" o "Consérvese en
congelación" o cualquier otra equivalente.
9.9 Para
productos deshidratados: "Consérvese en un lugar fresco y seco",
"Una vez preparado el producto, manténgase o consérvese en
refrigeración" o cualquier otra equivalente.
9.10 Para
dulces a base de leche de humedad baja e intermedia, debe indicarse "Manténgase
en lugar fresco y seco", o cualquier otra equivalente.
9.11 Los productos ultrapasteurizados
o esterilizados deben de incluir las leyendas "Manténgase o consérvese en
lugar fresco y seco". "No requiere refrigeración en tanto no se abra
el envase". "Refrigérese después de abrirse" o leyendas
equivalentes.
9.12 Los
productos objeto de esta norma que hayan sido modificados en su composición
nutrimental, deben ostentar junto a la denominación, con el mismo tipo y tamaño
de letra, la modificación que lo caracterice.
9.13 La
leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado, adicionados con vitamina D o
con vitaminas A y D, según corresponda, deben hacer figurar su contenido con
las siguientes leyendas:
9.13.1 "Contiene
_______ mg de
Vitamina D por L", o
9.13.2 "Contiene
_______ mg de
Vitamina D y _______ mg
equivalentes de retinol (Vitamina A)/L".
9.13.3 En el espacio en
blanco debe figurar el contenido de dichos nutrimentos, o sus equivalentes por
100 g, por porción o por envase, si éste contiene sólo una porción. El término
entre paréntesis es opcional.
9.13.4 El texto, "Adicionada
con Vitamina D" para los productos adicionados con Vitamina D3.
9.13.5 Cuando
voluntariamente se señalen dentro de la declaración nutrimental, deben figurar
como se señala a continuación:
Tabla 8
|
Nutrimento |
Cantidad por 100
g o por porción o por envase |
|
Vitamina A |
mg equivalentes de retinol |
|
Vitamina D |
mg |
9.14 Los productos con
modificación en su composición deben cumplir con lo señalado en la
NOM-086-SSA1-1994, citada en el apartado de referencias, a excepción de los
indicados en el numeral 9.8.2.1, los cuales deben cumplir con lo señalado en
este ordenamiento.
9.15 Cálculo de vitaminas
9.15.1 Vitamina A
1 UI de
vitamina A es equivalente a 0,3 mg equivalentes de retinol
(todos los Retinoles "trans").
9.15.2 Vitamina D3
1UI de vitamina D3 es equivalente a 0,025 mg de colecalciferol.
9.16 Leyendas
precautorias
9.16.1 Los productos que
contengan alcohol etílico o bebidas alcohólicas en cantidades superiores al
0,5%, deben incluir en la superficie principal de exhibición de la etiqueta, la
siguiente leyenda: "Este producto contiene ______% de alcohol. No
recomendable para niños". (En el espacio en blanco citar el contenido de
alcohol en %).
9.17 La cantidad de
proteínas que ha de indicarse, debe calcularse utilizando la siguiente fórmula:
Leche,
derivados o productos lácteos y quesos
Proteína
= contenido total de nitrógeno Kjeldahl X 6.38
Dulces
a base de leche, Helados, Sorbetes:
Proteína
= contenido total de nitrógeno Kjeldahl X 6.25
9.18 En el caso de que
los productos objeto de esta norma contengan o incluyan productos preenvasados
como parte de promociones u obsequios, tales como productos de panificación,
cereales, chocolate u otros alimentos, deben incluir en el envase del producto
de promoción u obsequio, cuando menos la siguiente información: lista de ingredientes,
identificación del responsable del producto, fecha de caducidad y lote.
9.19 Cuando en las
etiquetas se declaren u ostenten en forma escrita, gráfica o descriptiva que
los productos, su uso, aplicación, ingredientes o cualquier otra característica
están recomendados, respaldados o aceptados por centros de investigación,
asociaciones, organizaciones, entre otros, los cuales deberán contar con
reconocimiento nacional o internacional de su experiencia y estar calificados
para dar opinión sobre la información declarada. Se deberá contar con el
sustento técnico respectivo, el que estará a disposición de la Secretaría de
Salud en el momento que lo solicite. Dichas declaraciones deben sujetarse a lo
siguiente: la leyenda debe describir claramente la característica referida,
estar precedida por el símbolo o nombre del organismo y figurar en caracteres
claros y fácilmente legibles.
9.20 Los
productos destinados a ser reconstituidos o los contenidos en envases que
requieran instrucciones de uso o consumo especiales, deben incluir una
descripción escrita o gráfica de las instrucciones de uso, empleo o
preparación.
9.21 Los productos
envasados en punto de venta, deben ostentar la siguiente información:
9.21.1 Nombre o
denominación del producto.
9.21.2 Fecha de envasado
y, en su caso, fecha de caducidad, señalando el día y el mes y anteponiendo la
leyenda que corresponda "fecha de envasado _____", "fecha de
caducidad _____", o leyenda equivalente.
10. Concordancia con normas internacionales
Esta
norma es parcialmente equivalente a las siguientes normas:
10.1 Codex
Alimentarius. CODEX STAN 232-2001. Norma Nivel Máximo para la Aflatoxina M1 en la Leche.
10.2 Codex
Alimentarius. CODEX STAN A-9-1976, Rev. 1-2003. Norma del Codex Para Las Natas
(Cremas) Y Las Natas (Cremas) Preparadas.
10.3 Codex
Alimentarius. CODEX STAN A-6-1978, Rev. 1-1999, enmendado en 2006. Norma del
General del Codex para el Queso.
10.4 Codex
Alimentarius. CODEX STAN 221-2001. Norma colectiva para el Queso No Madurado,
Incluido el Queso Fresco.
11. Bibliografía
11.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización.
11.2 Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización.
11.3 Ley General de Salud.
11.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.
11.5 Norma Oficial Mexicana NOM-008-SCFI-1994. Sistema general de
unidades de medida. México, D.F.
11.6 Guía para la redacción, estructuración y presentación de las
normas oficiales mexicanas. NORMA-Z-13/02.
11.7 Food and Drug Administration. Grade "A"
Pasteurized Milk Ordinance. (2003 Revision). Department of Health and Human and
Services. U.S.A.
11.8
Fernández Escartín, E. 2000. "Microbiología e inocuidad de los
Alimentos". Universidad Autónoma de Querétaro.
11.9 Food and Agriculture Organization of the
United Nations. 1994. "Summary of evaluations performed by the Joint
FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA)". ILSI Press,
Washington.
11.10 U.S. Food & Drug Administration.
2001. Center for Food Safety & Apllied Nutrition. Foodborne pathogenic
microorganisms and natural toxins handbook. "Bad bug book".
11.11 Secretaría de
Salud. Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios. Aplicación
de Análisis de Riesgos, Identificación y Control de Puntos Críticos en la
Industria de la Leche Pasteurizada. México 1994.
11.12 Secretaría de
Salud. Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios.
Pasteurización de la Leche Controles y Exámenes Curso 302. Traducción de
documentos de la FDA. México, 1994.
11.13 Norma Mexicana
NMX-F-703-COFOCALEC-2004, Sistema de producto leche alimentos- lácteos leche
y producto lácteo (o alimento lácteo)- fermentado o acidificado
denominaciones, especificaciones y métodos de prueba.
11.14 Norma Mexicana
NMX-F-709-COFOCALEC-2004, Sistema producto leche alimento- alimento lácteo
regional- chongos zamoranos y producto lácteo tipo chongos zamoranos
denominaciones, especificaciones y métodos de prueba.
12. Observancia de la norma
12.1 La
vigilancia del cumplimiento de la presente norma corresponde a la Secretaría de
Salud, a los gobiernos de las entidades federativas, en el ámbito de sus
respectivas competencias.
13. Vigencia
13.1 La presente Norma
Oficial Mexicana entrará en vigor a los 60 días naturales posteriores a la
fecha de su publicación en el Diario Oficial de la Federación, a excepción de
los numerales 6.1.5.5 y 6.1.5.5.1 los cuales entrarán en vigor a los 365 días
naturales posteriores a la misma fecha.
Transitorio
Unico: Con la entrada en
vigor de la presente Norma Oficial Mexicana se cancelan las siguientes normas
oficiales mexicanas:
·
NOM-035-SSA1-1993, Bienes y servicios. Quesos de
suero. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la
Federación el 30 de enero de 1995.
·
NOM-036-SSA1-1993, Bienes y servicios. Helados de
crema, de leche o grasa vegetal, sorbetes y bases o mezclas para helados.
Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el
10 de marzo de 1995.
·
NOM-121-SSA1-1994, Bienes y servicios. Quesos:
frescos, madurados y procesados. Especificaciones sanitarias, publicada en el
Diario Oficial de la Federación el 23 de febrero de 1996.
·
NOM-184-SSA1-2002, Productos y servicios. Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado. Especificaciones sanitarias,
publicada en el Diario Oficial de la Federación el 23 de octubre de 2002
·
NOM-185-SSA1-2002, Productos y servicios.
Mantequilla, cremas, producto lácteo condensado azucarado, productos lácteos
fermentados y acidificados, dulces a base de leche. Especificaciones
Sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 16 de octubre de
2002.
Sufragio
Efectivo. No Reelección.
México, Distrito Federal, a 25 de
junio de 2010.- El Comisionado Federal para la Protección contra
Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización
de Regulación y Fomento Sanitario, Miguel
Angel Toscano Velasco.- Rúbrica.
APENDICE NORMATIVO
A
A.1 Límites Máximos para Aditivos Alimentarios.
|
Aditivo |
Límite máximo mg/kg |
Observaciones |
|
Acido acético glacial |
BPF |
Quesos frescos y
procesados. Leche fermentada o
acidificada. Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
Acido algínico |
10,000 |
Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
BPF |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos y
procesados |
|
|
Acido ascórbico * |
500 (expresado como ácido ascórbico) |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). Crema deshidratada. |
|
BPF |
Productos objeto de esta
norma saborizados o edulcorados. |
|
|
Acido benzoico y sus sales de sodio, potasio
y calcio |
1000 |
Cremas y mantequillas Dulces a base de leche. |
|
50 |
Leche fermentada o
acidificada ** |
|
|
Acido cítrico |
BPF |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado esterilizados saborizados. Quesos frescos y
procesados Mantequillas Para todo tipo de cremas
(incluyendo cremas acidificadas). Leche fermentada o
acidificada Dulces a base de leche Helados, sorbetes y bases
para helados |
|
Acido eritórbico |
BPF |
Dulces a base de leche. |
|
Acido fosfórico |
9,000 (total de compuestos de
fósforo añadidos, calculados como fósforo) |
Quesos frescos y
procesados |
|
3,000 (mezclado con otros
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Para todo tipo de cremas. |
|
|
2,000 (solo, expresado como sustancia anhidra). |
Para todo tipo de cremas. |
|
|
Acido fumárico |
BPF |
Leche fermentada o
acidificada. |
|
Acido L (+) tartárico |
BPF |
Leche fermentada o
acidificada. |
|
Acido láctico |
BPF |
Quesos frescos y
procesados Para todo tipo de cremas
(incluyendo cremas acidificadas) Leche fermentada o
acidificada Dulces a base de leche Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
Acido D,L-málico |
BPF |
Quesos frescos Leche fermentada o
acidificada Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
Acido propiónico |
BPF |
Quesos frescos y
procesados. |
|
Acido sórbico y sus sales de sodio, potasio y calcio |
3,000 (sólo o mezclado, expresado como ácido sórbico) |
Quesos frescos, procesados
y madurados Para todo tipo de cremas Mantequillas Bases para helados |
|
600 |
Dulces a base de leche. |
|
|
250 |
Leche fermentada y
acidificada. ** |
|
|
adipato
acetilado de dialmidón |
10,000 (sólo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Quesos frescos
saborizados (petit) Leche
fermentada y acidificada. |
|
BPF |
Dulces a base
de leche. |
|
|
agar |
5,000 (sólo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Para todo tipo
de cremas. Leche
fermentada y acidificada. Dulces a base
de leche. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. |
|
|
alginato de
amonio |
10,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
8,000 (sólo o mezclado con otros
espesantes) |
Quesos
procesados |
|
|
BPF |
Leche
fermentada o acidificada. Para todo tipo
de cremas Dulces a base
de leche. |
|
|
alginato de
calcio |
10,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
2,000 |
Leche
fermentada o acidificada |
|
|
BPF |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. Para todo tipo
de cremas |
|
|
Alginato de potasio |
10,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
2,000 |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
BPF |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. Para todo tipo
de cremas Leche
fermentada o acidificada Dulces a base
de leche. |
|
|
Alginato de propilenglicol |
10,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
8,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Quesos frescos
y procesados |
|
|
5,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Crema para
batir y crema vegetal. Dulces a base de leche. |
|
|
1,400 |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
|
Alginato de sodio |
10,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
2,000 |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
BPF |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. Para todo tipo
de cremas Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
Almidón acetilado |
20,000 solo o mezclado
con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este
apartado.) |
Leche fermentada
o acidificada. |
|
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Quesos frescos
saborizados (petit) |
|
|
BPF |
Dulces a base de leche. Quesos frescos
y procesados |
|
|
almidón oxidado |
20,000 solo o mezclado
con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este
apartado.) |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Quesos frescos
saborizados (petit) y quesos procesados. |
|
|
BPF |
Dulces a base
de leche. |
|
|
Almidones modificados |
20,000 solo o mezclado
con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este
apartado.) |
Leche
fermentada o acidificada Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Quesos frescos
saborizados (petit) y quesos procesados. |
|
|
BPF |
Dulces a base
de leche |
|
|
Amarillo ocaso FCF Amarillo alimentos 3 No. C.I. 15985 |
300 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche
condensada azucarada. |
|
200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Dulces a base
de leche. |
|
|
100 |
Quesos
saborizados Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
|
35 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
12 |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
Ascorbato de calcio* |
500 (expresado como ácido
ascórbico) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). |
|
ascorbato de
potasio* |
500 (expresado como ácido
ascórbico) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). |
|
ascorbato de
sodio * |
500 (expresado como ácido
ascórbico) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). Crema
deshidratada |
|
Azafrán (Estigmas de Crocus sativus L.) Amarillo natural 6 No. C.I 75100 |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
Azorrubina y sus lacas Rojo alimentos 3 y sus
lacas No. C.I. 14720 |
100 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados), helados,
sorbetes y bases para helados Quesos frescos
saborizados (petit) Leche
fermentada o acidificada. |
|
Azul brillante FCF y sus
lacas. Azul alimentos 2 y sus
lacas. No. C.I. 42090 |
200 |
Dulces a base
de leche. |
|
150 |
Leche
fermentada o acidificada. Quesos frescos
saborizados (petit) Crema para
batir Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
|
Beta caroteno sintético Anaranjado alimentos 5. No. C.I. 40800 |
600 |
Quesos
procesados. |
|
100 |
Leche
fermentada o acidificada |
|
|
35 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
25 |
Quesos
madurados. Mantequilla. |
|
|
Beta-apo-8'-carotenal Anaranjado alimentos 6. No. C.I. 40820 |
100 |
Helados, sorbetes y bases
para helados. Leche fermentada o
acidificada |
|
35 |
Quesos madurados y
procesados. |
|
|
35 |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
25 |
Mantequilla |
|
|
Butil hidroquinona terciaria |
200 |
Mantequilla (modificada en
su composición) |
|
100 |
Dulces a base de leche. |
|
|
Butil hidroxianisol |
200 |
Mantequilla (modificada en
su composición) |
|
100 |
Crema deshidratada y crema
vegetal deshidratada. Dulces a base de leche. |
|
|
Butil hidroxitolueno |
100 |
Dulces
a base de leche. |
|
200 |
Mantequillas
|
|
|
Cafeína |
400 |
Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
Cantaxantina Anaranjado alimentos 8. No. C.I. 40850 |
100 |
Helados, sorbetes y bases
para helados. |
|
Caramelo Clase I |
BPF |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados) Quesos frescos y
procesados Quesos saborizados Leche condensada azucarada Leche fermentada o
acidificada Dulces a base de leche Helados sorbetes y bases
para helados |
|
Caramelo Clase II |
3,200 |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
150 |
Leche condensada azucarada Leche fermentada o
acidificada Dulces a base de leche. |
|
|
100 |
Quesos saborizados Helados sorbetes y bases
para helado |
|
|
Caramelo Clase III |
150 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). Leche
condensada azucarada. Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base
de leche. |
|
100 |
Helados
sorbetes y bases para helado Quesos
saborizados |
|
|
Caramelo Clase IV |
150 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). Leche
condensada azucarada. Leche
fermentada y acidificada. Dulces a base
de leche. |
|
100 |
Helados,
sorbetes y bases para helados Quesos
saborizados |
|
|
Carbonato de amonio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Carbonato de calcio |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado, expresado como sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Crema deshidratada. Leche fermentada o acidificada |
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche
condensada azucarada. |
|
|
BPF |
Quesos frescos,
madurados y procesados Para todo tipo
de cremas |
|
|
Carbonato de magnesio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Carbonato de potasio |
5,000 (solo o mezclado con otros
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresado como sustancia anhidra). |
Crema deshidratada. |
|
3,000 (mezclado con otros
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche condensada
azucarada. |
|
|
BPF |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados). Para todo tipo de cremas |
|
|
Carbonato de sódio |
3,000 (mezclado con otros
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche condensada
azucarada. |
|
BPF |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados). Helados, sorbetes y bases
para helados Para todo tipo de
cremas. Mantequilla. |
|
|
Carbonato hidrogenado de amonio |
BPF |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Carbonato hidrogenado de potasio |
BPF |
Leche, fórmula láctea y
producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Carbonato hidrogenado de
sodio |
2,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado, expresado como sustancia anhidra). |
Mantequilla. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos y procesados Dulces a base de leche. |
|
|
Carboximetilcelulosa |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o modificados en su
composición). Quesos frescos,
madurados y procesados. Helados, sorbetes
y bases para helados. |
|
Carboximetilcelulosa de
sodio |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado) |
Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base de leche. Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o esterilizados). Quesos frescos
y procesados Todo tipo de
cremas |
|
|
Carotenos naturales Anaranjado alimentos 5. No. C.I. 75130 |
100 |
Leche
fermentada o acidificada |
|
100 |
Productos objeto
de esta norma, excepto: leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado. Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
|
600 |
Mantequilla Quesos frescos
y quesos madurados (corteza) |
|
|
Carragenato de calcio |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o modificados en su
composición). |
|
Carragenina y sus sales de potasio,
sodio y amonio |
10,000 (solo
o mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado). |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
8,000 (solo
o mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado). |
Quesos
procesados. |
|
|
BPF |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos
frescos Para
todo tipo de cremas Leche
fermentada o acidificados (cuajados naturalmente), Dulces
a base de leche Leche
condensada azucarada Productos
esterilizados. |
|
|
Celulosa microcristalina |
BPF |
Leches
saborizadas, leche fermentada o acidificadas. Quesos
madurados y quesos frescos Para
todo tipo de cremas. Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Cera blanca y amarilla de
abeja |
BPF |
Cobertura
de quesos. |
|
Cera de candelilla |
BPF |
Cobertura
de quesos. |
|
Cera de carnauba |
BPF |
Cobertura
de quesos. |
|
Cera de cascarilla de
arroz |
BPF |
Cobertura
de quesos. |
|
Cera microcristalina |
30,000 |
Cobertura
de quesos. |
|
Citrato de calcio |
3,000 (mezclado
con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este
apartado, expresados como sustancias anhidras). |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Fórmula
láctea y producto lácteo combinado. |
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Fórmula
láctea y producto lácteo combinado. |
|
|
BPF |
Quesos
frescos y procesados Todo
tipo de cremas Leche
fermentada o acidificada |
|
|
Citrato tripotásico |
5,000 (solo
o mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado, expresado como sustancia anhidra). |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Crema
deshidratada. |
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Fórmula
láctea y producto lácteo combinado. Todo
tipo de cremas Leche
condensada azucarada. |
|
|
BPF |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Quesos
frescos y procesados Todo
tipo de cremas Leche
condensada azucarada Leche
fermentada o acidificada |
|
|
Citrato trisódico |
5,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado, expresado como sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). |
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. Leche
condensada azucarada |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. Leche
condensada azucarada Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base
de leche |
|
|
BPF |
Quesos frescos
y procesados. Todo tipo de
cremas Leche
fermentada o acidificada |
|
|
Clorofilas Verde natural 3 No. C.I. 75810 |
BPF |
Quesos
saborizados, procesados y madurados Dulces a base
de leche |
|
Cloruro de calcio |
1,200 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra). |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Quesos frescos,
madurados y procesados. Dulces a base
de leche. Leche
condensada azucarada Todo tipo de
cremas |
|
|
Cloruro de potasio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Dulces a base de
leche. |
|
Complejos cúpricos de
clorofilas Verde natural 3. No. C.I. 75810 |
300 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
Curcumina Cúrcuma (Raíz de
Curcuma longa L.) No. C.I. 75300 |
100 |
Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base
de leche. Quesos frescos
y procesados |
|
50 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
|
D-alfa-tocoferol
concentrado |
300 |
Dulces a base
de leche. Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
Dextrinas |
20,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. Quesos frescos
y procesados Leche
fermentada o acidificada |
|
Dióxido de azufre |
50 |
Leche
fermentada o acidificada. ** |
|
Dióxido de silicón amorfo |
10,000 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Crema
deshidratada. |
|
Dióxido de titanio Pigmento blanco 6. No C.I. 77891 |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. Quesos frescos
y procesados. Dulces a base
de leche. Todo tipo de
cremas |
|
Dl-alfa tocoferol |
300 |
Dulces a base
de leche. Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
Eritrosina Rojo alimentos 14 No. C.I. 45430 |
2 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
27 |
Leche
fermentada o acidificada Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
|
Esteres acéticos de los
mono y diglicéridos de los ácidos grasos. |
BPF |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Todo tipo de
Crema. Quesos frescos
y madurados |
|
Esteres cítricos de los
mono y diglicéridos de los ácidos grasos |
BPF |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Todo tipo de
Crema. |
|
Esteres lácticos de los
mono y diglicéridos de los ácidos grasos |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado) |
Todo tipo de
cremas |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (modificados en su composición) Leches
saborizadas Fórmula láctea
y producto lácteo combinado Leche
fermentada o acidificada Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
|
Esteres diacetil
tartáricos de los mono y diglicéridos de los ácidos grasos. |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (modificados en su composición). |
|
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
|
BPF |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. Para todo tipo
de cremas. |
|
|
Esteres de
propilenglicol de ácidos grasos |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Esteres de ácidos grasos y
sacarosa |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
BPF |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
Eter apocarotenóico |
50 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Etil maltol |
50 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Etilvainillina |
1,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Extracto de annato (Extracto de semillas de Bixa orellana). Anaranjado natural 4. No. C.I. 75120 |
600 (calculado como bixina) |
Quesos
procesados. |
|
60 (calculado como bixina) |
Quesos
madurados. |
|
|
20 (calculado como bixina) |
Mantequilla. Dulces a base
de leche. |
|
|
10 (calculado como bixina) |
Leche
fermentada o acidificada |
|
|
0.05 (calculado como bixina) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
Extracto de cochinilla (Extracto de Coccus cacti L.). Rojo natural 4. No.
C.I. 75470 |
150 |
Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
100 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
50 |
Leche
fermentada o acidificados. Dulces a base
de leche. Quesos
saborizados |
|
|
BPF |
Leche
condensada azucarada. |
|
|
Fosfato de dialmidón
acetilado |
BPF |
Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base
de leche Quesos frescos
y procesados |
|
Fosfato de aluminio y
sodio |
1,000 |
Dulces a base
de leche. Quesos
procesados |
|
Fosfato de amonio |
1, 000 |
Dulces a base
de leche. |
|
Fosfato de dialmidón |
BPF |
Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base
de leche. Quesos frescos
y procesados |
|
Fosfato de hidroxipropil
dialmidón |
20,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche
fermentada o acidificada |
|
BPF |
Dulces a base
de leche. Quesos frescos
y procesados |
|
|
Fosfato hidrogenado de
magnesio |
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
Fosfato hidrogenado de
sodio |
9000 (solo o mezclado,
calculado como pentóxido de fósforo) |
Quesos
frescos y procesados |
|
5000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (deshidratados) |
|
|
3000 (mezclado con otros
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras) |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (esterilizados) |
|
|
2000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (esterilizado) |
|
|
1200 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado |
|
|
1000 |
Dulces
a base de leche |
|
|
500 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (modificados en su composición) |
|
|
150 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (ultrapasteurizados) |
|
|
BPF |
Leche,
fórmula láctea y producto lácteo combinado (saborizados) |
|
|
Fosfato de monoalmidón |
20,000 (solo o mezclado
con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este
apartado.) |
Leche
fermentada o acidificada |
|
BPF |
Dulces a base
de leche. Quesos frescos
y procesados |
|
|
Fosfato dihidrogenado de
calcio |
9000 |
Quesos
procesados |
|
Fosfato dihidrogenado de
potasio |
9,000 |
Quesos
procesados |
|
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). |
|
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
1,200 (solo o mezclado, expresado
como sustancia anhidra) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
500 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (modificados en su composición). |
|
|
150 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (ultrapasteurizados). |
|
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
|
Fosfato dihidrogenado de
sodio |
9000 |
Quesos
procesados |
|
Fosfato hidrogenado de
calcio |
9,000 (total de fosfatos,
calculados como fósforo) |
Quesos
procesados. |
|
3,000 (mezclado con otros
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
Fosfato fosfatado de
dialmidón |
20,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
BPF |
Dulces a base de leche. Quesos frescos
y procesados |
|
|
Fosfato hidrogenado
dipotásico |
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Quesos
procesados |
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
1,200 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
500 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (modificados en su composición). |
|
|
150 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (ultrapasteurizados). |
|
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
|
Fosfato
hidrogenado disódico |
30,000 (solo o mezclado,
expresado como pentóxido de fósforo) |
Quesos frescos
y procesados. |
|
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). |
|
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
1,200 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
1,000 |
Dulces a base
de leche. Cremas y cremas
para batir |
|
|
500 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (modificados en su composición). |
|
|
150 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (ultrapasteurizados). |
|
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
|
Fosfato monomagnésico |
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
Fosfato tricálcico |
9,000 "límite establecido
como emulsificante" (solo o mezclado,
calculado como pentóxido de fósforo) |
Quesos frescos
y procesados |
|
3,000 (mezclado con otros
fosfatos que se listen en este apartado, expresados como P2O5). |
Para todo tipo
de cremas. Leche
condensada azucarada |
|
|
2,000 (solo, expresado como P2O5). |
Para todo tipo
de cremas. Leche
condensada azucarada |
|
|
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
Fosfato trimagnésico |
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
Fosfato tripotásico |
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Crema
deshidratada. |
|
3,000 (mezclado con otros
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. Leche
condensada azucarada. |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. Leche
condensada azucarada. |
|
|
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
Fosfato trisódico |
9,000 (solo o mezclado,
calculado como pentóxido de fósforo) |
Quesos frescos
y procesados. |
|
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Crema
deshidratada. |
|
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. Leche
condensada azucarada. |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. Leche
condensada azucarada. |
|
|
2,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Mantequillas |
|
|
1,000 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
Galato de propilo |
90 |
Dulces a base
de leche. |
|
100 |
Mantequillas |
|
|
Glicerol |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Gluconato ferroso |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Glucono delta lactona |
BPF |
Todos los
quesos Leche
fermentada o acidificada |
|
Glutamato monosódico |
BPF |
Quesos frescos
y procesados |
|
Goma arábiga o acacia |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. Leche
fermentada o acidificada. Helados,
sorbetes y bases para helados Para
todo tipo de Crema. Dulces a base
de leche. |
|
|
Goma damar |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
|
Goma de algarrobo |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
5,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Para todo tipo
de Crema Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base
de leche. |
|
|
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Leche
fermentada o acidificada. Quesos frescos
y procesados. |
|
|
Goma gellana |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
|
Goma guar |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche esterilizada,
fórmula láctea y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. Leche
fermentada o acidificada. Helados,
sorbetes y bases para helados Para todo tipo
de Crema Dulces a base
de leche. |
|
|
Goma karaya |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
|
Goma tara |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados |
|
|
Goma tragacanto |
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
BPF |
Leche, fórmula láctea
y producto lácteo combinado (saborizados). Productos
lácteos acidificados. |
|
|
Goma Xantana |
5,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Para todo tipo
de cremas. Leche
fermentada o acidificados. Dulces a base
de leche. Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
1,200 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Quesos frescos
y procesados. Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
Hidróxido de amonio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Hidróxido de calcio |
2,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Mantequilla. |
|
Hidróxido de magnesio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Hidróxido de potasio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
2,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Mantequilla. |
|
|
Hidróxido de sodio |
BPF |
Quesos frescos Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados) Mantequillas
(modificadas en su composición) |
|
Hidroxipropil almidón |
BPF |
Leche
fermentada o acidificada. Dulces a base
de leche. Quesos frescos
y procesados |
|
Hidroxipropil metil
celulosa |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
|
Indigotina y
sus lacas. Azul alimentos 1 y sus lacas No. C.I. 73015 |
1000 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
300 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
100 |
Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
|
6 |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
Lactato de calcio |
BPF |
Para
todo tipo de Crema Leche
fermentada o acidificada Quesos
frescos |
|
Lactato de sodio |
BPF |
Para
todo tipo de Crema Quesos
frescos |
|
Lecitina |
5,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Quesos
procesados. |
|
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados, esterilizados o
deshidratados). Mantequilla. Dulces a base
de leche. Helados,
sorbetes y bases para helados Cremas
esterilizadas |
|
|
Maltodextrinas |
BPF |
Todos los
productos objeto de la norma. |
|
Metil celulosa |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Metil etil celulosa |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Esteres metílico y etílico
del ácido bapo-8´-
carotenóico o anaranjado alimentos 7 (éster etílico) |
35 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
Mono y diglicéridos |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Helados,
sorbetes y bases para helados Para
todo tipo de Cremas. |
|
2000 |
Leche Quesos
frescos, madurados y procesados. Leche
fermentada o acidificada |
|
|
BPF |
Dulces
a base de leche Leches,
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. |
|
|
Monoestearato de sorbitán |
5,000 |
Quesos frescos |
|
1,000 |
Para todo tipo
de cremas. Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
|
Monoestearato de sorbitán
polioxietilenado (20) |
1,000 |
Helados,
sorbetes y bases para helados. Para
todo tipo de cremas |
|
500 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizaos). |
|
|
Monolaurato de sorbitán
polioxietilenado |
1,000 |
Para
todo tipo de cremas. |
|
Monooleato de sorbitán
polioxietilenado |
1,000 |
Para
todo tipo de cremas. Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
Pimaricina. |
40 (solo para el
tratamiento de la superficie o corteza de los quesos, ausente a la
profundidad de 5 mm) |
Quesos
madurados |
|
Nisina |
12.5 |
Quesos
frescos, madurados y procesados. |
|
Nitrato de potasio |
50 |
Quesos
madurados. |
|
Nitrato de sodio |
50 |
Quesos
madurados. |
|
Octenil succinato sódico
de almidón |
10,000 |
Leche
fermentada o acidificada |
|
BPF |
Dulces a base
de leche. |
|
|
Oleorresina de paprika |
BPF |
Para
todos los productos objeto de esta norma. |
|
Oxido de magnesio |
10,000 |
Crema
deshidratada. |
|
Palmitato de amonio |
100 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). |
|
Palmitato de ascorbilo |
500 |
Crema
deshidratada. |
|
200 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
100 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). |
|
|
Palmitato de calcio |
100 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). |
|
Palmitato de potasio |
100 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). |
|
Palmitato de sodio |
100 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados o con grasa vegetal). |
|
Pectato de amonio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Pectato de calcio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Pectato de potasio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Pectato de sodio |
BPF |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). |
|
Pectinas |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. Leche
fermentada o acidificada Para
todo tipo de Cremas. Dulces a base de leche. Quesos
frescos y procesados |
|
Peróxido de hidrógeno |
BPF |
Quesos
madurados |
|
Piramicina o natamicina |
40 |
Quesos frescos
y procesados |
|
Pirofosfato tetrapotásico |
9000 |
Quesos
procesados |
|
Pirofosfato tetrasódico |
9000 |
Quesos
procesados |
|
Pirofosfato dicálcico |
9000 |
Quesos
procesados |
|
Polidextrosa |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado, dulces a base de leche, leche saborizada.
Todo tipo de cremas. Leche fermentada o acidificada |
|
Polifosfato de calcio |
9,000 |
Quesos frescos
y procesados |
|
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). |
|
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). |
|
|
Polifosfato de potasio |
9,000 |
Quesos frescos
y procesados |
|
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Crema
deshidratada. |
|
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. |
|
|
1,200 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
150 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche
ultrapasteurizada. |
|
|
Polifosfato de sodio |
9,000 |
Quesos frescos
y procesados |
|
5,000 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (deshidratados). Crema
deshidratada. |
|
|
3,000 (mezclado con
otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado,
expresados como sustancias anhidras). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. |
|
|
2,000 (solo, expresado como
sustancia anhidra). |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (esterilizados). Para todo tipo
de cremas. Dulces a base de leche |
|
|
1,200 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
150 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Leche
ultrapasteurizada. |
|
|
Ponceau 4R Rojo alimentos 7 No C.I.16255 |
150 |
Leche
condensada azucarada |
|
50 |
Helados, sorbetes
y bases para helados. Dulces a base
de leche. |
|
|
80 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
48 |
Leche fermentada o acidificada. Quesos saborizados |
|
|
Propionato de calcio |
BPF (sólo para el tratamiento
de la superficie) |
Quesos frescos
y procesados. |
|
Propionato de potasio |
BPF (sólo para el tratamiento
de la superficie) |
Quesos frescos
y procesados. |
|
Propionato de sodio |
BPF (sólo para el tratamiento
de la superficie) |
Quesos frescos
y procesados. |
|
Riboflavina |
10 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
BPF |
Quesos frescos,
madurados y procesados. |
|
|
Riboflavina-5´-fosfato de
sodio |
10 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
Rojo Allura AC y
sus lacas. Rojo alimentos 17 y
sus lacas. No. C.I. 16035 |
300 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche
condensada azucarada. Dulces a base
de leche. |
|
140 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
50 |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
Rojo betabel |
BPF |
Leche
fermentada o acidificada Leche
condensada azucarada. |
|
Sales de sodio y potasio
de complejos cúpricos de clorofilinas No C.I. 75810 |
300 |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
Sales de sodio, potasio o
calcio del ácido acético |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Sales de sodio, potasio o
calcio del ácido cítrico |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Sales de sodio, potasio o
calcio del ácido láctico |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Sales de sodio, potasio o
calcio del ácido málico |
BPF |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
Sales de sodio, potasio o
calcio del ácido tartárico |
BPF |
Helados, sorbetes
y bases para helados. |
|
Silicato de calcio |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Crema
deshidratada. |
|
Silicato de magnesio |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Crema
deshidratada. |
|
Sorbato de potasio |
3,000 (solo o mezclado,
expresado como ácido sórbico) |
Quesos
frescos, procesados y madurados Cremas,
mantequillas y bases para helado. |
|
600 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
200 |
Leche
fermentada o acidificada. ** |
|
|
Sorbato de sodio |
3,000 (solo o mezclado,
expresado como ácido sórbico) |
Quesos
frescos, procesados y madurados. Cremas,
mantequillas y bases para helado. |
|
200 |
Leche
fermentada o acidificada. ** |
|
|
Tartrazina y
sus lacas. Amarillo alimentos 4 y sus lacas. No. C.I. 19140 |
300 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche
condensada azucarada. |
|
200 |
Dulces a base
de leche. |
|
|
150 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
|
|
100 |
Helados,
sorbetes y bases para helados |
|
|
18 |
Leche
fermentada o acidificada. |
|
|
Triestearato de sorbitán
polioxietilenado (20) |
10,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Helados,
sorbetes y bases para helados. |
|
5,000 (solo o
mezclado con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en
este apartado.) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados). Para todo tipo
de cremas. |
|
|
Trifosfato pentapotásico |
9000 |
Quesos
procesados |
|
1100 |
Para todo tipo
de cremas |
|
|
120 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado |
|
|
Trifosfato pentasódico |
9000 |
Quesos
procesados |
|
1,200 (solo o mezclado,
expresado como sustancia anhidra) |
Fórmula láctea
y producto lácteo combinado. |
|
|
Verde rápido FCF y
sus lacas. Verde alimentos 3 y
sus lacas. |
100 (solo o mezclado
con otros aditivos que tengan la misma función y que se listen en este
apartado.) |
Leche, fórmula
láctea y producto lácteo combinado (saborizados o aromatizados). |
* No debe reportarse como nutrimento.
** Exclusivamente para leche fermentada o
acidificada preparados con vegetales.
A2. Enzimas o cultivos de microorganismos
A.2.1 Para la
elaboración de leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado, sometidos a
un proceso de trasformación parcial de la lactosa en glucosa y galactosa, se
permite emplear las siguientes enzimas:
|
Enzima |
Límite Máximo |
|
Lactasa derivada del Aspergillus niger |
BPF |
|
Lactasa derivada del Aspergillus oryzae |
BPF |
|
Lactasa derivada del Saccharomyces spp |
BPF |
|
Lactasa derivada del Kluyveromyces fragilis |
BPF |
|
Quimosina B derivada de Kluyveromyces lactis |
BPF |
Y aquellas mencionadas en el Acuerdo y sus modificaciones
A.2.2
Para la elaboración de los quesos frescos, madurados y procesados se permite
emplear las siguientes enzimas para cuajar la leche:
|
Enzima |
Límite Máximo |
|
Pepsina
derivada de estómagos de rumiantes y porcinos |
BPF |
|
Quimosina
A derivada de la Escherichia coli K12,
contiene gen de proquimosina A de ternera. |
BPF |
|
Quimosina
B derivada de Kluyveromyces lactis, contiene
gen de proquimiosina B de ternera. |
BPF |
|
Renina,
derivada de Bacillus cereus |
BPF |
|
Endothia parasitica |
BPF |
|
Rhizomucor miehei |
BPF |
Y aquellas mencionadas en el Acuerdo y sus modificaciones
A.2.3 Para la
elaboración de crema, dulces a base de leche, se permite emplear las enzimas
listadas en el Acuerdo y sus modificaciones, derivadas de las fuentes que ahí
se establecen y conforme a las BPF.
A.3 Saborizantes
A.3.1
Para la elaboración de los productos objeto de esta norma; se
permite emplear los saborizantes naturales y sintéticos de acuerdo a las BPF y
de conformidad con lo establecido en el Acuerdo y sus modificaciones.
A.4 Edulcorantes no nutritivos
A.4.1 Para la elaboración de leche productos edulcorados
y saborizados objeto de esta norma, se permite el empleo de edulcorantes no
nutritivos de conformidad con lo establecido en la NOM-086-SSA11994, citada en
el apartado de referencias.
A.5 Conservadores
A.5.1
Para la elaboración de leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado no se
permite el empleo de conservadores; a excepción de los productos saborizados o
aromatizados en los que sólo se permite la presencia de ácido
sórbico, ácido benzóico o las sales de sodio o potasio de los ácidos
anteriores, como efecto de la trasferencia de los ingredientes opcionales.
A.5.2 Para la
elaboración de helados, sorbetes y bases para helados, se permite la presencia
de conservadores como principio de transferencia de los ingredientes
opcionales.
APENDICE NORMATIVO
B
B.
METODOS DE PRUEBA
Precauciones
generales de seguridad.
El analista debe consultar siempre la
información respecto a la exposición y manejo seguro de los reactivos químicos
especificados en estos métodos, para emplear el equipo de seguridad apropiado
como bata de laboratorio, guantes de látex, anteojos de seguridad, mascarilla,
etc., y trabajar cuando así se requiera bajo campana de extracción.
Para la aplicación de los siguientes métodos
analíticos se debe cumplir con las Buenas Prácticas de Laboratorio.
B.1.
Recolección de la muestra
Utilizar un frasco estéril de vidrio o de
plástico provisto de tapón de cierre hermético, libre de fenol. Se recomienda
el empleo de tapones de hule. Transportar la muestra en una hielera con
refrigerante para lograr una temperatura de 2ºC a 7°C; para el caso de
productos congelados deben transportarse en congelación.
B.2.
Preparación de la muestra
Antes de proceder al estudio fisicoquímico
de la leche, homogeneizar la muestra por agitación e inversión repetida del
recipiente que la contiene. En los casos que se observe la formación de grumos,
calentar la muestra en baño de agua a temperatura aproximada de 38°C y emplear
un agitador con gendarme para facilitar el desprendimiento de la crema adherida
a la pared del frasco o del tapón.
Mantener la leche a 20°C al tomar las
alícuotas necesarias para los análisis.
B.3.
Determinación de Inhibidores
B.3.1.
Derivados Clorados (prueba cualitativa).
B.3.1.1.
Principio del método.
Cuando la muestra es tratada con ácido, se
libera el cloro presente, si este cloro se hace reaccionar con yoduro de
potasio y solución de almidón se desarrolla un color azul cuya intensidad va a
depender de la cantidad de cloro presente.
B.3.1.2.
Equipo.
B.3.1.2.1. Baño de agua a 85°C.
B.3.1.3.
Materiales.
B.3.1.3.1. Tubos de ensaye de 16 x 150 mm, o
equivalente.
B.3.1.3.2. Pipetas graduadas de 10 mL.
B.3.1.3.3. Agitadores de vidrio.
B.3.1.3.4. Embudos de filtración.
B.3.1.3.5. Papel filtro.
B.3.1.3.6. Baño de hielo.
B.3.1.4.
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico a menos
que se indique otra especificación y por agua debe entenderse agua destilada.
B.3.1.4.1.
Yoduro de potasio (KI). Solución al 7%.
B.3.1.4.2.
Acido clorhídrico (HCl) diluido 1:2. A 100 mL de ácido clorhídrico
agregar 200 mL de agua.
B.3.1.4.3.
Solución de almidón (C6H10O5)n. Suspender 1g de
almidón en un poco de agua fría, homogeneizar y agregarlo a 100 mL de agua
hirviendo, agitar hasta disolución completa, enfriar antes de usar. Utilizar
solución recientemente preparada.
B.3.1.5. Procedimiento.
B.3.1.5.1. En un
tubo de ensaye poner 5 mL de leche y agregarle 1,5 mL de solución de yoduro de
potasio al 7%, agregar 4 mL de HCl diluido y mezclar perfectamente con una
varilla de vidrio. Incluir una muestra control.
B.3.1.5.2.
Colocar los tubos en un baño de agua a 85°C y dejar reposar 10 min. Sacar los
tubos, enfriarlos rápidamente y colocarlos en baño de hielo. Filtrar, recoger
el filtrado en un tubo de ensaye. Agregar al filtrado 0,5 - 1,0 mL de solución
de almidón.
B.3.1.6.
Interpretación de resultados.
La aparición de un color azul grisáceo que
va desde el azul hasta el azul morado (de acuerdo con la concentración de cloro
presente), indica la presencia de cloro.
B.3.1.7.
Expresión de resultados.
|
Prueba positiva o negativa |
B.3.2.
Sales Cuaternarias de Amonio (prueba cualitativa).
B.3.2.1.
Principio del método
Cuando se hace reaccionar el ion cuaternario
de amonio en medio alcalino con un indicador (anaranjado de metilo) se forma un
complejo que es extraído con cloroformo, el cual en medio ácido da un color
magenta.
B.3.2.2.
Materiales
B.3.2.2.1. Matraces Erlenmeyer de 125 mL.
B.3.2.2.2. Mortero de porcelana de 10 cm de
diámetro.
B.3.2.2.3. Embudos de filtración.
B.3.2.2.4. Tubos de ensaye.
B.3.2.2.5. Pipetas graduadas de 10 mL.
B.3.2.3.
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico a menos
que se indique otra especificación y por agua debe entenderse agua destilada.
B.3.2.3.1. Anaranjado de metilo (C14H14N3NaO3S). Solución
acuosa al 0,15%.
B.3.2.3.2. Solución acuosa de hidróxido de
sodio (NaOH). Disolver 66,5 g de hidróxido de sodio en 100 mL de agua.
B.3.2.3.3. Cloroformo (CHCl3).
B.3.2.3.4. Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).
B.3.2.3.5. Acido clorhídrico (HCl) 2N.
B.3.2.3.6.
Cloruro de benzalconio [cloruro de n-alquil-(C12 a C18) bencildimetil amonio, con un intervalo de
peso molecular de 351-380 y conteniendo cadenas de los grupos alquilo con 12 y
16 átomos de carbono], al 0,06%. Para prepararlo considerar la concentración
inicial del reporte del fabricante.
B.3.2.4.
Procedimiento.
B.3.2.4.1.
Colocar 25 mL de leche en un matraz Erlenmeyer, agregar 0,5 mL de
solución acuosa de anaranjado de metilo, 1 mL de solución acuosa de hidróxido
de sodio y 20 mL de cloroformo, agitar 3 min.
B.3.2.4.2.
Pasar la emulsión resultante a un mortero al que previamente se le han
agregado 50 g de sulfato de sodio anhídro, triturar perfectamente, agregar 20
mL de cloroformo y filtrar. Al filtrado agregar 5 mL de ácido clorhídrico 2 N y
agitar.
B.3.2.4.3.
Preparar una solución control de color, colocando en un matraz
Erlenmeyer 25 mL de leche y 0,5 mL de la solución de cloruro de benzalconio al
0,06%. Proceder igual que en la muestra.
B.3.2.5.
Interpretación de resultados.
Un color magenta cereza en la capa acuosa es
una prueba positiva de cantidades mayores de 1 mg/kg de sales cuaternarias de
amonio.
B.3.2.6.
Expresión de resultados.
|
Prueba positiva o negativa. |
B.3.3.
Oxidante (prueba cualitativa).
B.3.3.1.
Principio del método.
Está basado en la formación de un compuesto
colorido al hacer reaccionar el agente oxidante (peróxido de hidrógeno) que
contenga la muestra con pentóxido de vanadio en presencia de ácido sulfúrico al
6% (v/v)
B.3.3.2.
Materiales.
B.3.3.2.1. Tubos de ensaye de 15 mL.
B.3.3.2.2. Pipetas graduadas de 5 y 10 mL.
B.3.3.2.3. Probetas de 100 mL.
B.3.3.3.
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico a menos
que se indique otra especificación y por agua debe entenderse agua destilada.
B.3.3.3.1.
Solución de ácido sulfúrico al 6%(v/v)
En un vaso de precipitados medir 94 mL de
agua y lentamente resbalando por las paredes, adicionar 6 mL de H2SO4 concentrado.
B.3.3.3.2.
Solución de pentóxido de vanadio (V2O5).
Disolver 1 g de pentóxido de vanadio en 100
mL de ácido sulfúrico 6 + 94.
B.3.3.4.
Procedimiento.
En un tubo de ensaye medir 10 mL de leche y
agregarle de 0,5 a 1,0 mL del reactivo de pentóxido de vanadio.
B.3.3.5.
Interpretación de Resultados.
La aparición de un color rosa o rojo, indica
la presencia de peróxido de hidrógeno (oxidante).
B.3.3.6.
Expresión de resultados.
|
Prueba positiva o negativa. |
B.3.4.
Determinación de Formaldehído (prueba cualitativa).
B.3.4.1.
Principio del método.
Se basa en la reacción del formaldehído con
la sal disódica del ácido cromotrópico formando una coloración de lila a
púrpura.
B.3.4.2.
Equipo.
B.3.4.2.1 Equipo de destilación Kjeldahl.
B.3.4.3.
Materiales.
B.3.4.3.1. Matraz Kjeldahl de 800 mL.
B.3.4.3.2. Material común de laboratorio.
B.3.4.4.
Reactivos.
Todos los reactivos deben ser grado
analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se entiende agua
destilada.
B.3.4.4.1. Acido
fosfórico (H3PO4).
B.3.4.4.2.
Sal disódica del ácido cromotrópico ( C10H8Na2O8S2).
B.3.4.4.3. Acido
sulfúrico concentrado (H2SO4).
B.3.4.4.4.
Formaldehído (CH2O) al
37%, densidad = 1,08 g/L.
B.3.4.4.5.
Solución de ácido sulfúrico al 72%. Verter 150 mL de ácido sulfúrico en 100 mL
de agua y enfriar.
B.3.4.4.6.
Solución saturada de sal disódica del ácido cromotrópico. Disolver 500 mg de
sal disódica del ácido cromotrópico en 100 mL de solución de ácido sulfúrico al
72%. Enfriar a temperatura ambiente.
B.3.4.4.7.
Solución de formaldehído de 40 mg/L. Tomar 1 mL de formaldehído y aforar a 1 L
con agua.
B.3.4.5.
Procedimiento.
B.3.4.5.1.
En el matraz de Kjeldahl tomar 100 mL de leche, adicionar 100 mL de agua
y acidificar con 2 mL ácido fosfórico adicionando 1 mL de exceso. Destilar 50
mL.
B.3.4.5.2.
En un tubo de ensaye poner 1 mL del destilado y 5 mL de solución
saturada de sal disódica del ácido cromotrópico, colocarlo en baño maría a
ebullición durante 15 minutos. Observar durante este periodo de calentamiento.
B.3.4.5.3.
Preparar una solución control de color, colocando en un matraz Kjeldahl, 100 mL
de leche y 1 mL de solución de formaldehído. Proceder como se describió en los
numerales B.3.4.5.1 y B.3.4.5.2.
B.3.4.6.
Interpretación de resultados.
La aparición de un color lila hasta púrpura
indica la presencia de formaldehído.
B.3.4.7.
Expresión de resultados.
|
Prueba positiva o negativa. |
B.3.5.
Inhibidores Determinados por Pruebas Microbiológicas (residuos de
antibióticos).
B.3.5.1.
Principio del método.
Las substancias inhibidoras del crecimiento
bacteriano presentes en la leche, se ponen de manifiesto por halos de
inhibición medibles, que se forman cuando se impregnan discos de papel filtro
con la muestra y se depositan sobre la superficie de una placa de agar
inoculado con esporas de B.
stearothermophilus.
B.3.5.2.
Equipo.
B.3.5.2.1. Autoclave.
B.3.5.2.2. Centrífuga (de preferencia
refrigerada).
B.3.5.2.3. Balanza granataria, de dos
platillos, sensibilidad 0,1 g y capacidad de 1000 g.
B.3.5.2.4. Balanza de precisión o analítica,
turbidímetro o uso de estándares de McFarland
B.3.5.2.5. Incubadora con termostato que
evite variaciones mayores a 1,0ºC.
B.3.5.2.6.
Microscopio óptico.
B.3.5.2.7.
Nefelómetro de McFarland.
B.3.5.2.8. Equipo para tinción de Gram y
esporas.
B.3.5.3.
Materiales.
B.3.5.3.1. Asa y portaasa bacteriológicas.
B.3.5.3.2. Cajas Petri de vidrio de 100 X 20
mm con tapa de porcelana vidriada en la parte exterior o su equivalente en
plástico, colocando un cojinete de papel filtro en la tapa.
B.3.5.3.3. Discos de papel de 12,7 mm de
diámetro gruesos, de velocidad media y con alta retención (S&S 740 E o
equivalentes en poder de absorción, calidad y pureza).
B.3.5.3.4. Matraces Erlenmeyer de 250 mL.
B.3.5.3.5. Micropipeta con capacidad para
medir 90 mL.
B.3.5.3.6. Pinzas de disección con punta
fina.
B.3.5.3.7. Porta objetos y puente de
tinción.
B.3.5.3.8. Tubos de cultivo con rosca de 13
X 100 mm.
B.3.5.3.9. Vernier o medidor de halos
B.3.5.3.10. Frascos con tapón de rosca
B.3.5.4.
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación
y por agua debe entenderse agua destilada.
B.3.5.4.1.
Subcultivo de Geobacillus
stearothermophilus ATCC10149 o Bacillus
calidolactis ATCC 10149.
B.3.5.4.2. Agar indicador PM.
|
Ingredientes |
Cantidad (g) |
|
Extracto de
carne |
3,0 |
|
Peptona |
5,0 |
|
Triptona |
1,7 |
|
Soytona |
0,3 |
|
Dextrosa |
5,25 |
|
Cloruro de sodio |
0,5 |
|
K2HPO4 |
0,25 |
|
Polisorbato 80 |
0,06 |
|
Púrpura de
Bromocresol |
0,06 |
|
Agar |
15,0 |
Preparación:
Disolver los ingredientes en un litro de
agua destilada. Calentar hasta disolución completa del agar. Ajustar el pH, si
es necesario. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.
pH final 7,8 + 0,2. Distribuir en
placas como se indica en B.3.5.5.5.
B.3.5.4.3. Caldo soya tripticasa (CST) sin dextrosa.
|
Ingredientes |
Cantidad (g) |
|
Peptona de
caseína |
17,0 |
|
Peptona de soya |
3,0 |
|
Cloruro de sodio |
5,0 |
|
Fosfato
dipotásico |
2,5 |
Preparación:
Disolver los ingredientes en un litro de
agua destilada. Ajustar el pH. Distribuir en frascos en cantidades según se
requiera. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min.
pH final 7,3 + 0,2.
B.3.5.4.4. Agar Soya Tripticasa (AST).
|
Ingredientes |
Cantidad (g) |
|
Peptona de
caseína |
15,0 |
|
Peptona de soya |
5,0 |
|
Cloruro de sodio |
5,0 |
|
Agar |
15,0 |
Preparación:
Disolver los ingredientes en un litro de
agua destilada. Calentar hasta disolución completa de agar. Ajustar el pH, si
es necesario. Esterilizar a 121ºC durante 15 min. Enfriar a 50-60ºC y
distribuir a placas de Petri. pH final 7,3 + 0,2.
B.3.5.4.5.
Penicilinasa (â- lactamasa). Se pueden adquirir discos
impregnados, de marca comercial que funcionan satisfactoriamente.
B.3.5.4.6.
Penicilina G (sustancia de referencia).
B.3.5.4.7.
Solución estéril de NaCI al 0,85% (m/v) (SS).
B.3.5.4.8.
Solución amortiguadora de fosfatos, pH 6.
B.3.5.5.
Procedimiento
B.3.5.5.1.
Preparación de la solución de trabajo de Penicilina G de referencia.
Pesar 30 mg de Penicilina G de referencia,
dentro de una atmósfera de humedad relativa menor a 50%. Disolver en solución
amortiguadora de fosfatos para obtener una concentración de 100-1000 Unidades
Internacionales/mL. Almacenar en la oscuridad entre 0-4,0ºC y usar dentro de
los dos días siguientes a su preparación.
B.3.5.5.2.
Preparación del inóculo.
B.3.5.5.2.1.
Mantener el cultivo de B.
stearothermophilus en medio inclinado de AST, haciendo pases semanales. A
partir de este cultivo inocular de 3 a 5 placas de AST, incubar a 55ºC -64ºC de
18-24 h. Cosechar el cultivo de cada placa con 2-3 mL de SS e inocular 3
matraces conteniendo cada uno 150 mL de CST sin dextrosa. Incubar a 55 - 64 +
2ºC.
B.3.5.5.2.2.
Periódicamente hacer una observación microscópica para determinar el grado de
esporulación del cultivo (aproximadamente el 80% del cultivo en 72 h, está en
fase esporulada). Centrifugar las células a 5000 rpm durante 15 min.
B.3.5.5.2.3.
Decantar el sobrenadante y resuspender las células en SS. Repetir el lavado,
suspender las células en 30 mL de SS y almacenar entre 0-4,0ºC. Esta suspensión
puede mantenerse viable durante 6-8 meses. Verificar su viabilidad mediante
cultivo en placas de AST.
B.3.5.5.3
Solución estándar de leche.
Diluir la solución de trabajo de Penicilina
G en leche libre de inhibidores para obtener una concentración de 0.008 UI/mL.
Usar recientemente preparado o almacenar entre 0-4,0ºC durante no más de 2
días, también se puede distribuir en pequeños volúmenes y congelar durante un
tiempo no mayor a 6 meses.
B.3.5.5.4.
Control Negativo.
Leche fluida con un contenido de grasa de
0,0% a 3,8% y sólidos totales menos del 13%. Comprobar la ausencia de
sustancias inhibidoras (comercialmente disponible).
B.3.5.5.5.
Preparación de las placas.
B.3.5.5.5.1.
Inocular el medio de agar indicador PM, fundido y enfriado a 55-64ºC con una
suspensión de esporas (B.3.5.5.2.3.), en cantidad suficiente para obtener 1 X
106/mL de
medio (cada laboratorio deberá ajustar el inóculo dependiendo de la
concentración de esporas obtenida). De esta suspensión, pasar 7,0 mL a placas
de Petri y dejar solidificar sobre una superficie nivelada.
B.3.5.5.5.2.
Utilizar las placas recientemente preparadas o almacenar entre 0-4,0ºC en
bolsas de plástico selladas e identificadas con la fecha de preparación. No
usar después de 5 días a su preparación.
B.3.5.5.6.
Prueba Preliminar.
B.3.5.5.6.1.
Agregar 90 µL de la muestra, usando micropipeta, asegurarse de que las puntas
estén bien colocadas, en posición vertical y en el centro del disco, evitar la
introducción de burbujas o colocar sobre la superficie de la muestra bien
mezclada un disco de papel sostenido con las pinzas, hasta que se impregne
completamente por capilaridad. Eliminar cualquier exceso de leche, tocar
ligeramente la superficie interna de la tapa y colocar el disco inmediatamente
sobre la placa de agar. Asegurar un completo contacto del papel filtro con el
agar, presionar con las pinzas suavemente (repetir esta operación con todas las
muestras).
B.3.5.5.6.2.
Colocar un disco control en el centro impregnado con el estándar de leche
(0,008 UI/mL de Penicilina G). Marcar e identificar los controles y las
muestras. Se recomienda no colocar más de 7 discos por placa: 6 en la orilla y
uno en el centro.
B.3.5.5.6.3.
Verificar que todos los discos estén uniformemente absorbidos sin presentar
exceso de leche y colocados en forma adecuada. Invertir las placas e incubar a
55-64ºC + 2ºC hasta que se observe una zona de inhibición bien definida
(16 - 20 mm) alrededor del disco control.
B.3.5.5.6.4.
Examinar las zonas de inhibición de las muestras y medir los halos con vernier.
Las zonas de inhibición < 14 mm se leen como negativo, zonas > 14
mm indican la presencia de inhibidores, lo cual deberá confirmarse.
B.3.5.5.7.
Prueba Confirmatoria.
Calentar las muestras a 82ºC + 2 min.
Enfriar rápidamente y continuar como se indica en B.3.5.5.5. Colocar también
discos impregnados de penicilinasa (comerciales) o agregar 0,05 mL de
penicilinasa a 5 mL de muestra e impregnar los discos.
B.3.5.5.8.
Controles
B.3.5.5.8.1. Cuando
se aplica este método, el analista debe estar seguro de que cualquier grado de
actividad antimicrobiana detectada, proviene de la muestra y nunca de las
condiciones ambientales, del equipo o reactivos usados; ni del propio analista.
B.3.5.5.8.2. Se
requiere, por lo tanto, aplicar las buenas prácticas de laboratorio y los controles
adecuados, a lo largo de todo el análisis.
B.3.5.5.8.3. El
control positivo que contiene solución de referencia de Penicilina G a una
concentración de 0,008 UI/mL debe producir zonas de inhibición claras y bien
definidas de aproximadamente 17-20 mm de diámetro. Si éstas no se presentan, la
prueba no demuestra la sensibilidad adecuada y deberá repetirse.
B.3.5.5.8.4. La
sensibilidad de este ensayo es normalmente > 0,008 UI/mL. El control
del diluyente, siempre debe dar
resultados negativos.
B.3.5.5.9.
Precauciones al realizar la prueba.
B.3.5.5.9.1. Para
colocar los discos, utilizar pinzas limpias y flameadas.
B.3.5.5.9.2. Tocar
con el disco la superficie de las muestras y permitir que el disco se sature
por capilaridad. Las pinzas deben flamearse y enfriarse entre cada muestra.
B.3.5.5.9.3. Tocar
la boca del recipiente con el disco, para eliminar el exceso de leche.
B.3.5.5.9.4.
Colocar el disco sobre el agar a una distancia de aproximadamente 9 mm de la
orilla hacia adentro y separados entre cada disco, unos 10 mm como mínimo.
Presionar el disco suavemente y asegurarse de que hace contacto toda su
superficie con el agar.
B.3.5.5.9.5.
Aplicar el control positivo en el centro de la placa y el control negativo en
cualquiera de los seis lugares de la orilla.
B.3.5.5.9.6.
Incubar las placas en posición invertida, en una cámara húmeda, a la
temperatura y el tiempo indicados en la metodología.
B.3.5.5.10.
Precauciones en el uso de la micropipeta.
B.3.5.5.10.1.
Homogeneizar la muestra. Fijar la punta a la micropipeta y en posición vertical
oprimir el émbolo hasta el primer tope.
B.3.5.5.10.2.
Introducir la punta 1 cm debajo de la superficie de la muestra. Soltar el
émbolo y dejar que la punta se llene.
B.3.5.5.10.3. Si el
émbolo se suelta rápidamente, el volumen de leche tomado no será uniforme. Si
la punta no está llena en forma correcta, después de soltar el émbolo,
descartar y repetir la operación.
B.3.5.6.
Interpretación de los Resultados.
Las pruebas: preliminar y confirmatoria,
pueden dar lugar a los siguientes resultados:
B.3.5.6.1.
Ausencia de zonas de inhibición en la prueba preliminar: la prueba es negativa
a sustancias inhibitorias.
B.3.5.6.2. Zonas
de inhibición alrededor de discos con muestra sin penicilinasa y ausencia de
zonas de inhibición alrededor de discos tratados con penicilinasa, en prueba
confirmatoria: la prueba es positiva a residuos de â-
lactámicos.
B.3.5.6.3.
Presencia de zonas de inhibición de igual tamaño en ambos discos (tratados y no
tratados con penicilinasa): prueba positiva a sustancias inhibidoras diferentes
a â-lactámicos.
B.3.5.6.4.
Presencia de zonas de inhibición de menor tamaño (4 mm) en discos tratados con
penicilinasa que los no tratados, en prueba confirmatoria: prueba positiva a
residuos de â-lactámicos y a otros inhibidores.
B.3.5.7.
Expresión de Resultados.
|
Prueba positiva o negativa. |
B.4.
Determinación de Fosfatasa Residual en leche, fórmula láctea, producto lácteo
combinado y derivados lácteos.
B.4.1.
Principio del método.
La muestra se incuba con fenilfosfato en solución
reguladora de hidróxido de bario. Si la fosfatasa activa está presente, el
fenilfosfato se hidroliza y se forma fenol.
Si la leche utilizada en la elaboración del
producto ha sido pasteurizada eficientemente, la fosfatasa se inactiva y no hay
hidrólisis.
El fenol formado se determina
colorimétricamente haciendo reaccionar con 2,6-dibromoquinonacloroimida
(B.Q.C.), obteniéndose un color azul, cuya intensidad se mide
espectrofotométricamente a 610 nm.
B.4.2.
Equipo.
B.4.2.1. Baño de agua con control de
temperatura a 37-40°C.
B.4.2.2. Parrilla de calentamiento, de
control termostático.
B.4.2.3. Espectrofotómetro de UV-Visible o
fotocolorímetro disponible para utilizarse a 610 nm con celdas de 1 cm de paso
óptico.
B.4.2.4. Balanza analítica con una precisión
de 0,1 mg.
B.4.3.
Materiales.
Todo el material de vidrio utilizado debe
someterse a una temperatura entre 85-90ºC durante una hora.
B.4.3.1. Tubos de ensaye de 15 x 150 mm.
B.4.3.2. Tubos de ensaye con graduación de 0
a 10 mL.
B.4.3.3. Pipetas graduadas en 0,1 mL de 1, 5 y 10 mL.
B.4.3.4. Embudos de filtración, tallo corto,
de 5 cm de diámetro.
B.4.3.5. Matraces volumétricos de diferentes
capacidades.
B.4.3.6. Papel filtro Whatman No. 42 o No. 2
o su equivalente.
B.4.3.7. Perilla de succión
B.4.3.8. Material común de laboratorio.
B.4.4.
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico y libres de fenol a menos que se indique
otra especificación y por agua debe entenderse agua destilada.
B.4.41. Hidróxido de bario
octahidratado [Ba(OH)2 . 8 H2O ].
B.4.4.2. Acido
bórico (H3BO3).
B.4.4.3.
Metaborato de sodio (NaBO2).
B.4.4.4.
Cloruro de sodio (NaCl).
B.4.4.5. Borato de sodio
decahidratado (Na2 B4O7 . 10 H2O).
B.4.4.6.
Fenilfosfato disódico (Na2C6H5PO4 )2H2O.
Cristales libres de fenol. Conservar en congelación o en desecador.
B.4.4.7.
Alcohol butílico (C4H10O). Punto de
ebullición 116-118°C.
B.4.4.8. Sulfato de zinc
heptahidratado (Zn SO4 . 7 H2O).
B.4.4.9. Sulfato de cobre
pentahidratado (CuSO4 . 5 H2O).
B.4.4.10. 2,6
Dibromoquinonacloroimida (BQC) C6H2OBr2NCl.
B.4.4.11. Fenol
(C6H6O).
B.4.4.12. Solución reguladora de hidróxido de
bario-borato (pH 10,6 ± 0,15 a 25°C).
Disolver en agua caliente 25 g de hidróxido
de bario octahidratado (fresco, no deteriorado), enfriar y diluir a 500 mL. Por separado, disolver 11 g de ácido bórico y
diluir a 500 mL. Calentar cada una de las soluciones a 50°C, mezclarlas, agitar
y enfriar aproximadamente a 20°C. Filtrar y conservar el filtrado en recipiente
perfectamente tapado y en refrigeración.
Cuando se aplique para leche, fórmula láctea
y producto lácteo combinado, pasteurizados descremados, sin sabor, diluir 500
mL de este regulador con 500 mL de agua.
Cuando se aplique para leche, fórmula láctea
y producto lácteo combinado, pasteurizados con sabor, diluir esta solución
reguladora con un cuarto de su volumen de agua (ejemplo 80 mL de este regulador
con 20 mL de agua).
Para leche de cabra esta solución reguladora
se prepara pesando 26 g de hidróxido de bario octahidratado en lugar de 25 g.
B.4.4.13.
Soluciones reguladoras de trabajo con fenil fosfato disódico.
B.4.4.13.1.
Para leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado pasteurizados.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en
100 mL de una mezcla de 50 mL de la solución reguladora de hidróxido de
bario-borato (B.4.4.12). En caso de que el fenil fosfato disódico no esté libre
de fenol debe ser purificado de la siguiente manera:
Disolver 0,5 g de la sal en 4,5 mL de agua;
agregar 0,5 mL de la solución reguladora de hidróxido de bario-borato
(B.4.4.12.) y dos gotas de reactivo B.Q.C. (B.4.4.18); dejar en reposo 30 min.
Al cabo de este tiempo agregar 2,5 mL de alcohol butílico y dejar en reposo
hasta que se separe el alcohol, con objeto de eliminar el color. Eliminar el
alcohol con gotero o pipeta Pasteur y descartar.
Diluir 1 mL de la solución acuosa a 100 mL
con el regulador de substrato (B.4.4.12). Calentar la solución a 85°C por 2
min, tapar inmediatamente y guardar en refrigeración. Esta solución madre debe mantenerse en el refrigerador durante
algunos días. Al emplearse, desarrollar el color y eliminarlo por extracción
como se ha indicado anteriormente. La solución es estable por un año si se
encuentra bien guardada y con mínima exposición al aire. Antes de usar, desarrollar el color y reextraer si es necesario.
B.4.4.13.2.
Para productos con sabor.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en
100 mL de una mezcla de 80 mL de la solución de hidróxido de bario (B.4.4.12.1)
y 20 mL de agua, mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración
B.4.4.13.3.Para
helados y sorbetes.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en
80 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.12.) y 20 mL de agua,
mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración.
B.4.4.13.4. Para sorbetes.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en
50 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.12) y 50 mL de agua,
mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración.
B.4.4.13.5. Para quesos y cremas pasteurizadas.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en
50 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.12) y 50 mL de agua,
mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración.
B.4.4.13.6.
Para mantequillas.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en
100 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.23) y 50 mL de agua,
mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración
B.4.4.14.
Solución reguladora para desarrollo de color (pH 9,8 ± 0,15 a 25°C).
Disolver 6 g de metaborato de sodio y 20 g
de cloruro de sodio en agua y diluir a un litro. Conservar en refrigeración.
B.4.4.15.
Solución reguladora para dilución de color. (Para el caso que la muestra haya
salido fuertemente positiva). Diluir 100 mL de la solución anterior
(B.4.4.14) a un litro con agua.
B.4.4.16.
Solución reguladora patrón para calibrar el potenciómetro (0,00996 M, pH 9,18 a
25°C).
Disolver 3,80 g de borato de sodio
decahidratado en agua y diluir a un litro (en ningún caso debe secarse esta sal
en el horno, antes de emplearse).
Para evitar contaminación con CO2 mantener
perfectamente tapado el recipiente o protegerlo con un tubo de cal sodada.
Esta solución reguladora debe utilizarse
dentro de los 10 min siguientes a su extracción del frasco.
B.4.4.17.
Reactivo precipitante de proteínas zinc-cobre.
B.4.4.17.1.
Para leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado pasteurizados sin sabor
y sorbetes.
Disolver 3 g de sulfato de zinc
heptahidratado y 0,6 g de sulfato de cobre pentahidratado en agua y diluir a
100 mL.
B.4.4.17.2.
Para leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado, pasteurizados con
sabor, helados y sorbetes.
Disolver
4,5 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0,1 g de sulfato de cobre
pentahidratado en agua y llevar a un volumen de 100 mL.
B.4.4.17.3. Para quesos
Disolver
6,0 g de sulfato de zinc heptahidratado en agua y diluir a 100 mL.
B.4.4.17.4. Para crema pasteurizada.
Disolver
3,0 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0,6 g de sulfato de cobre
pentahidratado en agua y llevar a un volumen de 100 mL.
B.4.4.17.5. Para mantequillas.
Disolver
4,5 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0,1 g de sulfato de cobre
pentahidratado en agua y llevar a un volumen de 100 mL. En caso de que la
mantequilla esté ácida, sustituir esta solución por la preparada en B.4.4.17.3.
B.4.4.18. Solución de
2,6-dibromoquinonacloroimida (B.Q.C.) (C6H2OBr2NCl).
Disolver
40 mg de polvo de BQC en 10 mL de alcohol etílico y conservar esta solución en
frasco gotero ámbar. Guardar en refrigeración. La solución es estable durante
una semana. Desechar si se torna color café.
Antes
de usarse los nuevos frascos de BQC deberán ser comprobados preparando curvas
patrón con fenol y comparados con los de la solución en buen estado; hacer esta
comprobación cuando menos dos veces por año.
B.4.4.19. Solución de sulfato de cobre para
patrones al 0,05%.
Disolver
0,05 g de sulfato de cobre pentahidratado en 100 mL de agua.
B.4.4.20. Solución de alcohol butílico.
Para
ajustar su pH, mezclar un litro de éste, con 50 mL de la solución reguladora
para desarrollo de color (B.4.4.15). Conservar en frasco de tapón de vidrio
esmerilado.
B.4.4.21. Solución madre de fenol de 1
mg/mL.
Pesar
exactamente 1,0 g de fenol, transferir a un matraz volumétrico de un litro y
llevar al volumen con agua. Mezclar perfectamente. Esta solución es estable
durante varios meses mantenida en refrigeración.
B.4.4.22. Solución patrón de fenol de 10 mg/mL o 10 unidades/mL (solución de trabajo).
Diluir
10 mL de la solución madre (B.4.4.21) a un litro con agua y mezclar
perfectamente.
Para
preparar soluciones patrón más diluidas, diluir 5, 10, 30 y 50 mL de esta
solución en 100 mL para que respectivamente contengan 0,5; 1,0; 3,0 y 5,0 mg o unidades de
fenol por mL. Estas soluciones patrón mantenidas en refrigeración no se deben
emplear después de una semana.
De
manera semejante preparar las soluciones patrón que contengan 20, 30 y 40
unidades por mL. Guardar en refrigeración y permitir que esté a la temperatura
ambiente en el momento de su uso.
B.4.4.23. Solución reguladora de
borato-hidróxido de bario (18:8 m/v). únicamente para mantequillas.
Disolver
en agua caliente 18 g de hidróxido de bario octahidratado (fresco, no
deteriorado) y diluir a 500 mL. Por separado, disolver 8 g de ácido bórico en
agua caliente, enfriar y diluir a 500 mL. Calentar cada una de las soluciones a
50°C, mezclarlas, agitar y enfriar aproximadamente a 20°C. Filtrar y conservar
el filtrado en recipiente perfectamente tapado y en refrigeración.
B.4.4.24. Solución reguladora de sustrato
(para valorar la pasteurización).
Disolver
0,10 g de fenilfosfato disódico en 100 mL de una mezcla de 50 mL de la solución reguladora de hidróxido de
bario-borato (B.4.4.12) en 50 mL de agua. En caso de no obtener esta sal libre
de fenol, debe ser purificada como sigue:
Disolver
0,5 g de la sal en 4,5 mL de agua; agregar 0,5 mL de la solución reguladora de
hidróxido de bario-borato (B.4.4.12) y
dos gotas de reactivo B.Q.C. (B.4.4.18); dejar en reposo 30 min. Al cabo de
este tiempo agregar 2,5 mL de alcohol butílico y dejar en reposo hasta que se
separe el alcohol, con objeto de eliminar el color. Eliminar el alcohol con
gotero o pipeta Pasteur.
Diluir
1 mL de la solución acuosa a 100 mL con el regulador de sustrato (B.4.4.12.).
Calentar la solución a 85°C por 2 min, tapar inmediatamente y guardar en el
refrigerador. Esta solución madre debe mantenerse en el refrigerador durante
algunos días. Al emplearse, desarrollar el color y eliminarlo por extracción
como se ha indicado anteriormente. La solución es estable por un año si se
encuentra bien guardada y con mínima exposición al aire. Antes de usar,
desarrollar el color y reextraer si es necesario.
B.4.5.
Procedimiento
B.4.5.1.
Preparación de la curva patrón de comparación.
B.4.5.1.1. En
series de tubos (de preferencia graduados en 5 y 10 mL), medir volúmenes adecuados
de la solución patrón de trabajo, a fin de obtener un margen favorable de
patrones según las necesidades. Se recomienda incluir 0,0 (testigo), 0,5; 5,0;
1,0; 3,0; 10,0; 20,0; 30,0 y 40,0 unidades.
B.4.5.1.2. Con
objeto de aumentar la intensidad del color azul y la estabilidad de los
patrones agregar a cada tubo 1 mL de la solución de sulfato de cobre al 0,05%
(4.4.19) y a continuación 5 mL de la solución reguladora para dilución de color
(B.4.4.15). Llevar a un volumen de 10 mL con agua. Agregar 4 gotas de la
solución B.Q.C. (B.4.4.18.) mezclar y dejar en reposo 30 min, a temperatura
ambiente para desarrollo de color.
B.4.5.1.3. En
caso de emplear el procedimiento de extracción con alcohol butílico normal,
proceder como se indica más adelante.
B.4.5.1.4. Hacer
la lectura de la intensidad del color con un espectrofotómetro a 610
nanómetros, restar el valor que alcanza la lectura del testigo a la de cada una
de las soluciones patrones de fenol; finalmente construir una curva de
calibración la cual debe ajustarse mediante el método de mínimos cuadrados
(regresión lineal).
B.4.5.1.5.
.Si se pretende efectuar una comparación visual de los patrones, se
conservan en refrigeración y se prepara una nueva serie cada semana.
B.4.5.1.6. Para
el caso de la determinación de fosfatasa en leche, fórmula láctea o producto
lácteo combinado, es fundamental la homogenización antes de desarrollar la
técnica. Colocar varios mililitros en un tubo de ensaye pequeño, tapar y
guardar en el refrigerador; si es necesario el empleo de un conservador agregar
cloroformo en concentraciones de 1-3 mL por cada 100 mL de leche, fórmula
láctea o producto lácteo combinado.
B.4.5.2.
Preparación de la Muestra.
B.4.5.2.1.
Leche fórmula láctea o producto lácteo combinado.
B.4.5.2.1.1. Medir
con pipeta 1 mL de muestra preparada de leche en 2 o 3 tubos (se necesita un
tubo como testigo y se recomienda preparar dos o más tubos para determinaciones
por duplicado); en caso de la leche de cabra emplear 3,0 mL de la muestra.
B.4.5.2.1.2.
Agregar a cada tubo 10 mL de la solución reguladora de trabajo con fenil
fosfato disódico (B.4.4.13.1.) o para las determinaciones cuantitativas en
leche cruda; tapar los tubos y mezclar (pH 10,0 ± 0,15).
B.4.5.2.1.3.
Calentar el tubo testigo en un baño de agua a ebullición cubierto durante 1 min
(la temperatura interna del tubo debe estar entre 85-90°C). Dejar enfriar a
temperatura ambiente y mezclar de nuevo con el agitador.
B.4.5.2.2.
Productos saborizados, helados y sorbetes.
B.4.5.2.2.1. Pesar
1,0 g de muestra (de preferencia por duplicado), colocar en un tubo (si la
muestra es pegajosa, pesar en papel encerado de 2,5 x 2,5 cm e insertar el
papel con la muestra dentro del tubo). De la misma forma pesar otra cantidad
igual que servirá de muestra testigo.
B.4.5.2.2.2. Calentar
el tubo testigo en un baño de agua a ebullición cubierto durante 1 min (la
temperatura interna del tubo debe estar entre 85-90°C). Dejar enfriar a
temperatura ambiente y mezclar de nuevo con el agitador.
B.4.5.2.2.3.
Agregar a los tubos con muestra 1 mL de la solución reguladora de trabajo
correspondiente (B.4.4.13.), mezclar con el agitador de vidrio. A partir de
esta etapa manejar de igual forma el testigo y las muestras.
B.4.5.2.2.4.
Agregar 10 mL de la solución reguladora correspondiente:
Para productos saborizados (B.4.4.13.2).
Para helados y sorbetes (B.4.4.13.3).
Para sorbetes (B.4.4.13.4).
B.4.5.2.3.
Mantequilla.
B.4.5.2.3.1. Pesar
1,0 g de muestra (de preferencia por duplicado) en piezas de papel encerado de
2,5 cm, insertar el papel con la muestra dentro de un tubo de ensaye. De la
misma forma pesar otra cantidad de muestra que servirá de testigo.
B.4.5.2.3.2.
Calentar el tubo con la muestra testigo en un baño de agua a ebullición y
cubierto, durante un minuto (la temperatura interna del tubo debe estar entre
85 y 90°C), y dejar enfriar a temperatura ambiente. A partir de esta etapa
manejar de igual manera el testigo y las muestras.
Agregar a cada tubo 10 mL de la solución
reguladora de trabajo (B.4.4.13.6), tapar los tubos y mezclar.
B.4.5.2.4.
Quesos y crema pasteurizada.
B.4.5.2.4.1. Pesar
0,5 g de queso o 1,0 g de crema (de preferencia por duplicado), colocar en tubo
(si la muestra es pegajosa, pesar en papel encerado de 2,5 x 2,5 cm e insertar
el papel con la muestra dentro del tubo). De la misma forma, pesar otra
cantidad de la muestra que servirá como testigo.
B.4.5.2.4.2.
Agregar al tubo que contiene la muestra testigo 1 mL de solución reguladora de borato-hidróxido de bario. Calentar en un baño
a ebullición y cubierto, durante un minuto.
B.4.5.2.4.3.
Agregar a los tubos con muestra, 10 mL de la solución reguladora de
trabajo correspondiente (B.4.4.13.7), mezclar con el agitador de vidrio. A
partir de esta etapa manejar de igual forma que el testigo y las muestras
(excepto para crema vieja o ligeramente agria en donde se agregan 7 mL de la
solución reguladora de trabajo y 2 mL de agua) para hacer un volumen total de
10 mL.
B.4.5.2.4.4.
Mezclar (el agitador de vidrio puede quedarse durante la incubación o retirarse
en este paso). Si se retira, enrollar una pieza de 2,5 x 2,5 cm de papel filtro
apretado alrededor del agitador y secarlo por rotación mientras se retira el
tubo. Introducir el papel en el tubo.
Nota: La
temperatura interna del tubo que contiene la muestra testigo que debe estar
entre 85-90°C, es controlada con un termómetro sumergido en un tubo de tamaño y
volumen igual al de las pruebas.
B.4.5.3.
Determinación de Fosfatasa Residual (Esta parte del
procedimiento es común a todos los derivados lácteos).
B.4.5.3.1.
Inmediatamente después de agregar la solución de substrato, incubar los tubos
en baño de agua durante una hora a 37-38°C agitando ocasionalmente durante este
tiempo. Trasladar los tubos a un recipiente con agua a ebullición durante 1
min. Dejar enfriar los tubos a la temperatura ambiente por inmersión en un
recipiente de agua fría.
B.4.5.3.2.
Agregar con una pipeta 1 mL de la solución precipitante de proteínas zinc-cobre
correspondiente (B.4.4.17) a los tubos de la siguiente manera:
a) Para
leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado, sin sabor y sorbetes adicionar la solución (B.4.4.17.1).
b) Para
leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado, pasteurizados con sabor,
helados y sorbetes, adicionar la solución (B.4.4.17.2).
c) Para
quesos adicionar la solución (B.4.4.17.3).
d) Para
cremas adicionar la solución (B.4.4.17.4).
e) Para
mantequillas adicionar la solución (B.4.4.17.5).
B.4.5.3.3.
Mezclar perfectamente el contenido de los tubos. El pH de la mezcla debe estar
entre 9,0-9,1; filtrar (empleando embudos de 5 cm de diámetro y papel filtro
No. 42 de 9 cm de diámetro o bien el No. 2 o su equivalente). Recoger 5 mL del
filtrado en un tubo, de preferencia graduado en 5 y 10 mL.
B.4.5.3.4.
Agregar 5 mL de solución reguladora para desarrollo de color (B.4.4.14). El pH
de la mezcla debe estar entre 9,3-9,4.
B.4.5.3.5
Agregar 4 gotas del reactivo B.Q.C. (B.4.4.18), mezclar y dejar a temperatura
ambiente durante 30 min para desarrollo de color. En los casos en que se
investigue pasteurización deficiente se agregan 2 gotas del reactivo de B.Q.C.
B.4.5.3.6.
Determinar la Intensidad del color azul con cualquiera de los siguientes
métodos:
a)
Método espectrofotométrico.
Leer las intensidades de color del tubo
testigo y de las muestras a 610 nm, restar la lectura del testigo de la lectura
del tubo de la muestra y convertir el resultado a unidades de fenol, utilizando
la curva patrón (B.4.5.1).
Ordinariamente se hace innecesaria la
extracción con alcohol butílico cuando se emplea el espectrofotómetro. En los
casos en que se emplee la extracción con este alcohol, purificar el reactivo
como se señala en la valoración de la pasteurización (B.4.4.13.1), centrifugar
la muestra durante 5 min a fin de romper la emulsión y remover el agua
suspendida en la capa alcohólica. Después de centrifugar, con una pipeta
capilar provista de bulbo de hule, separar todo el alcohol butílico. Filtrar y
recoger el filtrado en la celda del espectrofotómetro y leer a 610 nm.
b)
Método visual con escala de patrones.
Comparar los colores de las muestras que dan
más de 5 unidades con los tubos de color que contienen patrones de fenol
(B.4.5.1).
Para obtener resultados cuantitativos en
aquellos casos en que haya variaciones entre 0,5 y 5 unidades de color, hacer
la extracción con alcohol butílico, agregando 5 mL de alcohol e invirtiendo
lentamente varias veces; centrifugar como se señala en el método anterior, si
fuera necesario, para aumentar la claridad de la capa alcohólica y comparar el
color con los patrones tratados en igual forma.
En aquellas pruebas en las que durante el
desarrollo de color se obtengan resultados fuertemente positivos (por ejemplo
con 20 unidades o más) y en las cuales no sean suficientes 4 gotas del reactivo
de B.Q.C. (B.4.4.18) para reaccionar con todo el fenol, hacer diluciones colocando
nuevos tubos con volúmenes conocidos que se diluyen a 10 mL con la solución
reguladora de dilución de color (B.4.4.15) y agregar 2 o más gotas del reactivo
B.Q.C. En cada una de estas pruebas diluir el testigo y tratarlo directamente.
De la misma manera en aquellos casos en los
que estas nuevas diluciones produzcan nuevamente reacciones fuertemente
positivas, todavía será necesario volver a preparar otras diluciones más, hasta
que el color quede comprendido entre los de la escala o de la curva del espectrofotómetro.
Para hacer la lectura final, dejar
transcurrir 30 min a partir del momento de la adición del reactivo B.Q.C a fin
de que se desarrolle totalmente su color. Multiplicar las lecturas de las
diluciones por el factor de dilución por 2 en el caso de haber diluido 5 mL;
por 10, para aquella dilución inicial 1+9 mL y por 50, en caso de una dilución
inicial 1+9 mL, seguida de otra de 2+ 8 mL.
B.4.6.
Cálculos.
B.4.6.1.
Para leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado, pasteurizados u otros
productos lácteos donde se mide 1 mL de muestra líquida y se
adicionan 11 mL de los reactivos (el volumen total del líquido es de 12 mL) y
se emplean 5 mL del filtrado.
U. de Fenol/mL = C x 2,4
B.4.6.2.
Para productos saborizados, helados y sorbetes donde se pesan 1
g de la muestra y se agregan 11 mL de los reactivos (el volumen total del
líquido es de 12 mL) y se emplean 5 mL del filtrado.
U. de Fenol/g = C x 2,2
donde:
C = concentración de la muestra obtenida de
la gráfica de la curva patrón en unidades fenol/mL.
2,2 y 2,4 = Factores de dilución.
B.4.6.3.
Para mantequilla y crema donde se pesa 1 g de la muestra y se
adicionan 11 mL de los reactivos (el volumen total del líquido es de 12 mL) y
se emplean 5 mL del filtrado.
U. de Fenol/ g = C x 2.4
B.4.6.4.
Para queso donde se pesa 0,5 g de muestra y se agregan 11 mL
de los reactivos (el volumen total del líquido es de 12 mL) y se emplean 5 mL
del filtrado.
U. de Fenol/g = C x 4,4
donde:
C = concentración de la muestra obtenida de
la gráfica de la curva patrón en unidades fenol/mL.
2.2. y 4.4.= Factores de dilución con
respecto a los diferentes productos.
B.4.7. Expresión
de resultados.
|
Unidades de fenol / mL o g. |
B.5.
Determinación de Materia Extraña en leche, fórmula láctea, producto lácteo
combinado, dulces de leche, helados, mantequilla y cremas.
B.5.1.
Principio del método.
Los insectos enteros, fragmentos de los
mismos, pelos de roedor o alguna materia extraña se separan de la muestra por
filtración para su identificación al microscopio.
B.5.2.
Equipo
B.5.2.1. Balanza analítica con 0,1 mg de
sensibilidad.
B.5.2.2. Equipo de filtración al vacío.
B.5.2.3. Microscopio binocular estereoscopio
con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10 X, oculares apareados de amplio
campo visual de 10, 30 y 100 X, respectivamente.
B.5.2.4. Lámpara para el microscopio o luz
natural equivalente.
B.5.3.
Materiales.
B.5.3.1. Embudo Büchner.
B.5.3.2. Matraz Kitazato.
B.5.3.3. Vasos de precipitados de 1000 mL
B.5.3.4. Caja Petri.
B.5.3.5. Papel de filtración rápida para
conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
B.5.3.6. Material común de laboratorio.
B.5.4.
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación
y por agua debe entenderse agua destilada.
B.5.4.1. Mezcla
de glicerina:etanol 1:3 (v/v) (opcional).
B.5.5.
Procedimiento.
B.5.5.1.
Preparación de la muestra.
B.5.5.1.1.
Productos líquidos.
Mezclar bien todo el contenido de la
muestra.
B.5.5.1.2.
Productos deshidratados.
Pesar por duplicado 50 g de leche descremada
o 65 g de leche entera y reconstituir ajustando el volumen a 500 mL con agua a
40ºC.
B.5.5.2.
Determinación.
B.5.5.2.1.
Filtrar toda la muestra sobre un embudo de succión preparado con papel
filtro para conteo, tratando de vertirlo uniformemente.
B.5.5.2.2. Durante la
filtración lavar continuamente el papel filtro con agua a 80ºC aproximadamente,
para evitar la acumulación de partículas que tapen los poros del papel.
B.5.5.2.3. Pasar el papel
filtro a una caja Petri y humedecerla con la mezcla glicerina-etanol
(opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte
que muestre los detalles en el papel filtro.
B.5.5.2.4. Contar con una
aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea y
explorar cada pieza del material dado que algunos fragmentos son irreconocibles
a menos que se muevan.
B.5.6 Expresión de
resultados.
B.5.6.1. Productos deshidratados.
|
Presencia
o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos de roedor y
cualquier materia extraña que se encuentre en 50 g o 65 g de muestra. |
B.5.6.2. Productos líquidos.
|
Presencia
o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos de roedor y
cualquier materia extraña que se encuentre en la cantidad de mL que contenga
el envase analizado. |
B.6. Determinación de materia extraña en quesos.
Método de filtración.
B.6.1. Principio del método.
La
materia extraña debe separarse por sedimentación y posteriormente filtrarse
para su observación al microscopio.
B.6.2. Equipo
B.6.2.1.
Parrilla de calentamiento con agitación magnética.
B.6.2.2.
Equipo de filtración al vacío.
B.6.2.3.
Microscopio binocular estereoscópico con objetivo que pueden ser de 3,6,7 y 10x
y oculares apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 x respectivamente.
B.6.3. Materiales
B.6.3.1.
Cuchillo
B.6.3.2.
Vaso de precipitados de 2 L
B.6.3.3.
Termómetro graduado de 0°C a 100°C
B.6.3.4.
Embudo Buchner
B.6.3.5.
Matraz Kitasato de 1 L
B.6.3.6.
Papel filtro Whatman # 1 de diámetro igual al tamaño del embudo
B.6.3.7
Barra magnética
B.6.3.8.
Material común de laboratorio
B.6.4. Reactivos.
Todos
los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra
especificación y por agua se entiende agua destilada.
B.6.4.1. Acido fosfórico 1:40 (H3PO4).
Mezclar
un volumen de ácido fosfórico en 40 volúmenes de agua.
B.6.4..2. Solución de hidróxido de sodio al
5% (Na OH).
Disolver
5 gramos de hidróxido de sodio en agua y diluir a 100 mL.
B.6.4.2. Etanol (C2H5O)
B.6.5. Procedimiento.
B.6.5.1. Cortar 50 g del producto
en cubos, de aproximadamente 6 mm y pasarlos a un vaso de 2 L, adicionar de 800
a 1000 mL de solución hirviente de ácido fosfórico (1:40) y con un agitador
magnético, agitar continuamente a baja velocidad aproximadamente 20 min. o
hasta que la muestra se haya dispersado.
B.6.5.2. Filtrar sin
permitir que la muestra se acumule en el papel y para evitar que el filtro se
obstruya lavar continuamente con porciones de agua casi a ebullición. En caso
de obstrucción agregar al agua de lavado, una solución alcalina diluida
(Hidróxido de sodio al 5% o ácido fosfórico 1:40 o alcohol caliente), hasta que
el filtro quede limpio, entonces adicionar la muestra en suspensión remanente
en el vaso y agua. Examinar el papel filtro al microscopio.
B.6.6.
Informe de la Prueba.
Presencia o ausencia de insectos enteros,
fragmentos de insectos, pelos de roedor, excretas o cualquier materia extraña
en 50 g de producto.
B.7.
Determinación de Arsénico, Plomo, Mercurio y Estaño.
B.7.1.
Fundamento
El método de absorción atómica se basa en
hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia tal que puede ser
absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor atómico.
La medida de intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor
atómico permite determinar el por ciento de absorción.
La cantidad de absorción aumenta con la
concentración de átomos en el medio absorbente, es decir, la media de la
absorción aumenta con la concentración del elemento de la muestra, ya
sea que esté en su condición original o sujeta a pretratamiento.
B.7.2.
Materiales
B.7.2.1.
Matraces Kjeldahl de 500 mL y 800 mL.
B.7.2.2.
Sistema de reflujo con refrigerante.
B.7.2.3.
Crisoles Vycor de 40 a 50 mL de capacidad.
B.7.2.4.
Crisoles de platino de 40 a 50 mL de capacidad.
B.7.2.5.
Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades.
B.7.2.6.
Matraces volumétricos de diferentes capacidades.
B.7.2.7.
Matraces redondos de fondo plano de 50 mL.
B.7.2.8.
Bombas Parr.
B.7.2.9.
Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades.
B.7.2.10.
Puntas de plástico para micropipetas.
B.7.2.11.
Papel filtro Whatman No. 2.
B.7.2.12.
Perlas de ebullición.
B.7.2.13.
Varillas de plástico.
B.7.2.14.
Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 mL.
B.7.2.15.
Recipientes de propilen o propileno.
B.7.2.16.
Embudos de filtración de diferentes capacidades.
B.7.2.17.
Material común de laboratorio.
B.7.2.18. Todo el material utilizado debe someterse a
lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones:
B.7.2.18.1. El
jabón que se use debe ser de preferencia neutro.
B.7.2.18.2.
Enjuagar perfectamente con agua corriente.
B.7.2.18.3.
Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia
plástico) que contenga una solución de ácido nítrico grado RA al 30 %.
B.7.2.18.4.
Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas.
B.7.2.18.5.
Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con
agua deionizada.
B.7.2.18.6. Dejar
escurrir y secar.
B.7.2.18.7.
Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el
aire.
B.7.3.
Equipo
B.7.3.1.
Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico,
cadmio, cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc.
B.7.3.2. Fuente
de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga.
B.7.3.3.
Automuestreador y recirculador de agua.
B.7.3.4. Placa
de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC.
B.7.3.5. Horno
de microondas.
B.7.3.6.
Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión.
B.7.3.7.
Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm.
B.7.3.8.
Espectrómetro de absorción atómica equipado con los accesorios para
flama, horno de grafito, generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del
método a seguir.
B.7.3.9.
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg.
B.7.3.10. Mufla
capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10ºC.
B.7.3.11. Horno
de calentamiento (estufa) con intervalo de temperatura de 120 ± 5ºC.
B.7.3.12.
Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y
ajustados antes de su operación.
B.7.4.
Reactivos
B.7.4.1.
Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales.
Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1
µmho/cm a 25ºC.
B.7.4.2. Acido
nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro o de alta pureza para el
análisis de metales o equivalente
B.7.4.3. Acido
nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo.
B.7.4.4.
Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro, o de alta
pureza para el análisis de metales o equivalente
B.7.4.5.
Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro, o de alta
pureza para el análisis de metales o equivalente
B.7.4.6. Acido
sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro, o de alta pureza para el
análisis de metales o equivalente
B.7.4.7 Acido
sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro, o de alta pureza para el
análisis de metales o equivalente
B.7.4.8 Acido
nítrico 65% v/v grado RA.
B.7.4.9
Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12).
B.7.4.10
Hidróxido de sodio granalla reactivo RA.
B.7.4.11 Aire
comprimido seco y limpio.
B.7.4.12 Gases:
acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno, grado absorción atómica.
B.7.4.13
Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O en 1000 mL de
HCl 1N.
B.7.4.14 Acido
clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 mL de HCl y llevar a 100 mL de agua.
B.7.4.15 Acido
nítrico al 50% v/v. Diluir 50 mL de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 mL de
agua.
B.7.4.16 Acido
clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.
B.7.4.17 Acido
clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.
B.7.4.18
Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 mL de agua
(esta solución debe prepararse en el momento de usarse).
B.7.4.19
Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 mL de agua
(esta solución debe prepararse en el momento de usarse).
B.7.4.20
Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/mL de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua
y diluir a 100 mL con agua.
B.7.4.21
Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en
100 mL de agua.
B.7.4.22
Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 mL de HCl en 100 mL de
agua destilada deionizada.
B.7.4.23
Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y
diluir a 100 mL con agua destilada deionizada.
B.7.4.24
Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al
1% p/v. Pesar 4 g de borohidruro de sodio en 100 mL de una solución de
hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío.
B.7.4.25
Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 mL de ácido sulfúrico concentrado
con aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver
15 g de cloruro de sodio, 15 g de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de
cloruro o sulfato estanoso en solución. Diluir a 500 mL.
B.7.4.26
Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a
500 mL de agua destilada deionizada, agregar 58 mL de ácido nítrico concentrado
de muy baja concentración de mercurio y 67 mL de ácido sulfúrico concentrado.
Diluir al volumen con agua.
B.7.4.27
Solución de trabajo de As de 1 µg/mL. Diluir 1 mL de la solución patrón de 1000
µg/mL a 1l con ácido sulfúrico 1N preparada a partir de la solución grado
suprapuro. Preparar fresca cada día.
B.7.5
Preparación de la Muestra
B.7.5.1
Digestión por Vía Húmeda para la determinación de Pb.
B.7.5.1.1 Pesar
con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.
Para la determinación por el método de
absorción por flama pesar como máximo 40 g de líquidos, 20 g de alimentos que
contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos.
Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia
orgánica a 5 g.
B.7.5.1.2 Añadir
10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar
directamente la digestión.
B.7.5.1.3 Usar
matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes.
B.7.5.1.4
Calentar suavemente.
B.7.5.1.5
Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es necesario (algunas muestras
requieren la adición de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición del
color traslúcido, si queda ámbar, adicionar peróxido de hidrógeno gota a gota
con agitación continua (reacción exotérmica).
B.7.5.1.6
Enfriar.
B.7.5.1.7
Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico. Se
pueden hacer tantas diluciones sean necesarias de acuerdo a la cantidad
contenido del metal.
B.7.5.1.8. Correr
un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.7.5.1.9 Leer
en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica por flama u horno
de grafito).
B.7.5.2
Digestión por Vía Seca para la determinación de Pb.
B.7.5.2.1 Pesar
con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.
B.7.5.2.2 Para
la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de
jugo o bebida, 20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de
alimentos sólidos y semisólidos. Límite el contenido de grasa o aceite a un
máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5g.
B.7.5.2.3 Añadir
10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar
directamente la digestión. En productos con alta concentración de proteínas
adicionar una solución de nitrato de magnesio al 7,0% p/v y mezclar
completamente, llevar a sequedad aproximadamente durante 6 horas en estufa a
una temperatura de 90 a 95ºC.
B.7.5.2.4
Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4ºC
por minuto hasta 350°C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos.
B.7.5.2.5 Elevar
gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC para evitar que la muestra se
incinere y mantener esa temperatura durante 16 horas o toda la noche.
B.7.5.2.6 Apagar
la mufla y dejar enfriar.
B.7.5.2.7
Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos
residuos de carbón, mediante el siguiente procedimiento: Lavar las paredes del
crisol con 2 mL de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa de
calentamiento puesta a 120ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la
muestra en una mufla fría y elevar la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC,
manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir este procedimiento cuantas veces
sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente.
B.7.5.2.8
Disolver las cenizas completamente en 5 mL de ácido clorhídrico 1N,
transferir la muestra disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volumen
conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 mL de ácido clorhídrico 1 N
y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 mL en el
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia
de partículas o materia insoluble, filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la
determinación. Se pueden hacer tantas diluciones sean necesarias de acuerdo a
la cantidad contenido del metal.
B.7.5.2.9
Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de
digestión.
B.7.5.2.10 Leer
en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de
grafito).
B.7.5.3
Digestión por Vía Húmeda para la determinación de Sn
B.7.5.3.1
Proceder igual que en el punto B.7.5.1.1.
B.7.5.3.2 No
adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día.
B.7.5.3.3
Adicionar 30 mL de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente
por 15 minutos en campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva
producción de espuma.
B.7.5.3.4 Hervir
suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 mL o hasta que la muestra empiece
a secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine.
B.7.5.3.5
Retirar la muestra del calor.
B.7.5.3.6 Al
mismo tiempo correr dos blancos de reactivos.
B.7.5.3.7
Adicionar 25 mL de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro sea liberado. Aumentar la
temperatura gradualmente hasta ebullición.
B.7.5.3.8
Evaporar hasta obtener de 10 a 15 mL usando un matraz similar con 15 mL de agua
como patrón de volumen.
B.7.5.3.9
Adicionar aproximadamente 40 mL de agua.
B.7.5.3.10 Agitar
y pasar a un matraz de 100 mL y enjuagar con 10 mL de agua.
B.7.5.3.11 Cuando
el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden
quedar toda la noche o por más tiempo.
B.7.5.3.12
Agregar 1 mL de solución de cloruro de potasio en cada matraz.
B.7.5.3.13
Enfriar a temperatura ambiente.
B.7.5.3.14 Diluir
con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz.
B.7.5.3.15
Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 mL a través de un papel filtro
Whatman No. 2 y recoger el filtrado en un recipiente de propileno,
polipropileno o polietileno.
B.7.5.3.16 No
filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son
estables por varios meses.
B.7.5.3.17 Correr
un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.7.5.3.18 Leer
en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de
grafito).
B.7.5.4
Digestión por Vía Húmeda para la determinación de Hg.
B.7.5.4.1
Sistema de Reflujo.
B.7.5.4.1.1 Pesar
como máximo 40g de líquidos, 20g de alimentos que contengan del 50 al 75% de
agua y 10g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el contenido de grasa o
aceite a un máximo de 4g y el total de la materia orgánica a 5g
B.7.5.4.1.2
Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad
necesaria de ácido nítrico concentrado y calentar durante media hora o hasta
que no se observen cambios en la digestión.
B.7.5.4.1.3 Dejar
enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1
+ 1).
B.7.5.4.1.4
Calentar y agregar más ácido nítrico gota a gota sobre las paredes del
recipiente, hasta que el color obscuro de la solución desaparezca.
B.7.5.4.1.5
Enfriar.
B.7.5.4.1.6 Si
existe grasa o cera filtrar la solución. Se pueden hacer tantas diluciones sean
necesarias de acuerdo a la cantidad contenido del metal.
B.7.5.4.1.7 Correr
un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.7.5.4.1.8 Leer
en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).
B.7.5.4.2
Sistema Cerrado.
B.7.5.4.2.1 Pesar
con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el
tipo de ésta, en el recipiente de digestión.
B.7.5.4.2.2
Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado.
B.7.5.4.2.3 Tapar
y sellar perfectamente el recipiente de digestión.
B.7.5.4.2.4 Si el
recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave
a 15lb por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla
controlando la temperatura a un máximo de 300ºC por 30 minutos.
B.7.5.4.2.5
Enfriar a temperatura ambiente.
B.7.5.4.2.6 En
caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir
la digestión.
B.7.5.4.2.7
Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg.
B.7.5.4.2.8 Correr
un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.7.5.4.2.9 Leer
en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).
B.7.5.5
Digestión por Vía Húmeda-Seca para la determinación de As.
B.7.5.5.1
Proceder como en el punto B.7.4.4.2 hasta que la digestión sea completa y
posteriormente continuar con los siguientes pasos.
B.7.5.5.2 Con una
pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un
crisol Vycor
B.7.5.5.3 Añadir
1 mL de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a
temperatura baja, hasta sequedad.
B.7.5.5.4
Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375ºC.
B.7.5.5.5
Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30
minutos.
B.7.5.5.6
Enfriar y disolver el residuo en 2,0 mL de ácido clorhídrico 8 M.
B.7.5.5.7 Añadir
0,1 mL de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III).
B.7.5.5.8 Dejar
reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y transferir a un matraz y llevar al
aforo con agua.
B.7.5.5.9 Correr
un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.7.5.5.10 Leer
en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación
para horno de grafito o generador de hidruros).
B.7.5.6 Digestión por Vía Seca para la determinación
de As.
B.7.5.6.1 Pesar
como máximo 40g de líquidos, 20g de alimentos que contengan del 50 al 75% de
agua y 10g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el contenido de grasa o
aceite a un máximo de 4g y el total de la materia orgánica a 5g
B.7.5.6.2 Añadir
el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v.
B.7.5.6.3
Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el
crisol.
B.7.5.6.4
Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta
300ºC por 2 horas. Posteriormente subir gradualmente la temperatura hasta 500ºC
por 16 horas o durante toda la noche.
B.7.5.6.5
Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50%
v/v.
B.7.5.6.6
Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido.
B.7.5.6.7 Llevar
los crisoles a una mufla elevando gradualmente la temperatura de 23 a 500ºC,
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total.
B.7.5.6.8
Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10
mL de ácido clorhídrico 0,5 N.
B.7.5.6.9
Enjuagar los crisoles con 5 mL de agua destilada y transferir al matraz, añadir
1 mL de solución de yoduro de potasio al 15% y mezclar.
B.7.5.6.10 Dejar
reposar durante 15 minutos y llevar al aforo.
B.7.5.6.11 Correr
un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.7.5.6.12 Leer
en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación
para horno de grafito o generador de hidruros).
B.7.5.7 Digestión para la determinación de
As, Pb, Sn, y Hg por horno de microondas.
B.7.5.7.1 Pesar con
precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máximo de muestra, añadir 6 mL de ácido
nítrico concentrado y 2 mL de agua oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el
envase de reacción y proceder según el manual del fabricante.
B.7.6 Procedimiento
B.7.6.1 Espectrometría de Absorción Atómica
por Flama.
B.7.6.1.1 Calibración.
B.7.6.1.1.1 Es necesario
comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.
B.7.6.1.1.2 Se inicia la
configuración operacional del instrumento y en el sistema de adquisición de
datos. Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las
lámparas de descarga sin electrodos.
B.7.6.1.1.3 Se debe verificar
la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 20
veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el
analito, leída un mínimo de cinco veces y calculando la desviación estándar
resultante, la cual debe ser menor al 5%.
B.7.6.1.1.4 El instrumento
debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco de calibración y
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración
dentro del intervalo dinámico de concentración del analito.
B.7.6.1.1.5 Ajustar el
instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de
calibración del analito de menor a mayor concentración y registrar al menos
tres réplicas de la absorbancia de cada uno.
B.7.6.1.1.6 Elaborar una
curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración. Lo
anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los
cuales sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración
teórica.
B.7.6.1.2 Operación del Instrumento.
B.7.6.1.2.1 El desempeño del
instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibración,
estándares de calibración y una muestra de control de calidad (MCC).
B.7.6.1.2.2 Después de que se
ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de
calidad. Si las mediciones varían en ± 10% o más, al valor establecido para la
MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la posible causa de error, el
instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibración.
B.7.6.1.2.3 Para verificar
que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analito difiere ± 10% o más,
el instrumento debe recalibrarse. Si el error persiste debe identificarse el
problema y corregirse. Si la matriz de la muestra es responsable de la deriva o
afecta la respuesta del analito puede ser necesario trabajar por adiciones
estándar.
B.7.6.1.2.4 La demostración
de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites de
detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración
lineal. Para determinar el LDM se usa un blanco de reactivos fortificado con
una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de detección
estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectura de absorbancia del blanco de
reactivos fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM
se calculan de acuerdo a:
LDM= t x s
t = valor de la
"T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación
estándar estimada para n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas.
s = desviación
estándar de las réplicas del análisis.
El intervalo
lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de
diferente concentración, uno de los cuales debe estar próximo al límite
superior del intervalo lineal.
B.7.6.1.3 Determinación.
B.7.6.1.3.1 Ajustar el
instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la
determinación del analito de acuerdo a las indicaciones del manual del
instrumento.
B.7.6.1.3.2 Introducir el
blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de
absorbancia. Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de
muestras. Los valores obtenidos ponen de manifiesto la calidad de los reactivos
usados y el grado de contaminación del laboratorio.
B.7.6.1.3.3 En los equipos
que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración
del elemento en las unidades de concentración utilizadas.
B.7.6.1.3.4 Se debe analizar
al menos un blanco de reactivos fortificado para cada grupo de muestras. Se
calcula la exactitud como el por ciento de recuperación (de acuerdo al apartado
B.7.5.1.2.4).
B.7.6.1.3.5 Se debe
fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte
mayor. La concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de
absorbancia.
B.7.6.1.3.6 Se debe calcular
el por ciento de recuperación para el analito, de acuerdo a:
CM
- C
R = --------------
x 100
CA
R = % recuperación
CM = Concentración de la muestra fortificada
C = Concentración de la muestra
CA = Concentración equivalente de analito
añadido a la muestra.
B.7.6.1.3.7 Si la
recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo
previamente establecido y el blanco de reactivos fortificado está correcto,
puede existir un problema relacionado con la matriz de la muestra. Los datos se
deben verificar por el método de las adiciones estándar.
B.7.6.2
Espectrometría de Absorción Atómica por Horno de Grafito.
B.7.6.2.1
Calibración.
B.7.6.2.1.1
Proceder de acuerdo a los puntos B.7.5.1
B.7.6.2.1.2
Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima
contra concentración del analito.
B.7.6.2.1.3 La
calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el
ajuste sobre los datos de concentración respuesta es aceptada.
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos
que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario introducir los
estándares y marcar su concentración teórica.
B.7.6.2.2
Operación del Instrumento.
B.7.6.2.2.1
Proceder de acuerdo a B.7.5.1
B.7.6.2.3
Determinación.
B.7.6.2.3.1
Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para
la determinación del analito, de acuerdo a las recomendaciones del manual del
instrumento.
El programa de temperaturas para el horno de
grafito puede variar dependiendo de la matriz de la muestra. En el caso de
existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la
luz), se recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto a los métodos
disponibles para eliminarlas, así como en el caso de interferencias de matriz.
B.7.6.3
Espectrometría de Absorción Atómica por Generador de Hidruros.
B.7.6.3.1
Calibración.
B.7.6.3.1.1
Proceder de acuerdo a los puntos B.7.5.1
B.7.6.3.1.2 A
partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As
de 1 mg/l en ácido clorhídrico de concentración apropiada al método. Trazar una
curva de calibración de absorbancia (máximo de la altura de pico) en función de
la concentración del analito para un intervalo de concentración de 0 a 10 µg/l
de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra.
B.7.6.3.2
Operación del Instrumento.
B.7.6.3.2.1
Proceder de acuerdo a B.7.5.1
B.7.6.3.3
Determinación
B.7.6.3.3.1
Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para
la determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin
electrodos. Colocar y ajustar la celda de absorción de acuerdo al manual del
fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).
B.7.6.3.3.2
Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al
1,5% siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.
B.7.6.3.3.3
Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al
analito (por lo general, 10 mL de una solución de 5 µg/l de As da una
absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo de reacción y el
tiempo de purga II.
B.7.6.3.3.4 Tomar
un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que
con los estándares de calibración.
B.7.6.4
Espectrometría de Absorción Atómica por Vapor Frío.
B.7.6.4.1
Calibración.
B.7.6.4.1.1
Proceder de acuerdo a los puntos B.7.5.1
B.7.6.4.1.2 A partir
de la solución de trabajo de 1 µg/mL preparar estándares de calibración que
contengan 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de reacción. A cada
frasco agregar 100 mL de la solución de dilución y 20 mL de la solución de
reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura máxima de
pico) en función de la concentración del analito.
B.7.6.4.2
Operación del Instrumento.
B.7.6.4.2.1
Proceder de acuerdo a B.7.5.1
B.7.6.4.3
Determinación.
B.7.6.4.3.1
Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para
la determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lámpara de
cátodo hueco. Colocar y ajustar la celda de absorción de acuerdo al manual del
fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).
B.7.6.4.3.2
Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y
de reducción) siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.
B.7.6.4.3.3
Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al
analito.
B.7.6.4.3.4 Tomar
25 mL de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los
estándares de calibración.
B.7.7
Expresión de Resultados
B.7.7.1.
Método de Cálculo.
Interpolar los valores de absorbancia o
altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y obtener los
mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente
fórmula:
|
mg/ kg = |
A x B |
|
C |
en donde:
A = Concentración en mg/kg de la muestra a
interpolar en la curva de calibración.
B = Volumen final al que se llevó la muestra
(mL).
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la
muestra (mL) en el caso de agua.
En los equipos que pueden programarse, la
lectura obtenida da directamente la concentración del elemento en mg/kg o
µg/kg.
B.7.8
Informe de la Prueba
Los resultados se informarán en mg/kg o
µg/kg del elemento a determinar.
B.8.
Determinación de AFM1 en leche, fórmula láctea o producto lácteo
combinado por columna de inmunoafinidad- HPLC.
B.8.1
Principio del Método.
La AFM1 es
extraída por aplicación de la porción de prueba (leche líquida o leche
deshidratada reconstituida) a una columna de inmunoafinidad, la cual contiene
anticuerpos monoclonales específicos ligados a un material de soporte sólido.
Así como la muestra pasa a través de la columna, los anticuerpos selectivamente
se ligan a la AFM1 presente
para formar un complejo antígeno-anticuerpo. Los otros componentes de la matriz
de la muestra son removidos de la columna con agua destilada. La AFM1 es
eluída de la columna con acetonitrilo y cuantificada por HPLC en fase reversa
con detección de fluorescencia.
B.8.2 Equipo.
B.8.2.1 Sistema HPLC, que incluye:
B.8.2.2 Bomba
B.8.2.3 Inyector automático o manual de
muestras.
B.8.2.4 Columna HPLC C18 de 4.6 x 250 mm,
5 µm de tamaño partícula.
B.8.2.5 Detector de fluorescencia
B.8.2.6 Integrador de datos o computadora
personal con el software adecuado para el control del equipo y procesamiento de
datos
B.8.2.7 Bomba manual (cuerpo de jeringa de
vidrio de 50 mL unida a través de un conector de plástico a un suministro de
aire) o manifold para extracción por vacío en fase sólida.
B.8.2.8 Centrífuga a 2000 rpm.
B.8.2.9 Mezclador tipo vórtex.
B.8.2.10 Balanza analítica de lectura 0,1
mg.
B.8.211 Espectrofotómetro capaz de hacer
mediciones de 200 a 400 nm.
B.8.2.12 Equipo de filtración Millipore o
similar.
B.8.2.13 Sistema de evaporación de muestras
multipuesto en baño seco con bomba de vacío.
B.8.2.14 Extractor en fase sólida o Vaccum
manifold
B.8.2.15 Bomba de vacío
B.8.3.
Materiales
B.8.3.1 Columnas de inmunoafinidad. Se
sugiere adquirir columnas con una capacidad de carga de no menos de 100ng de
AFM1.
B.8.3.2 Tubos de centrífuga.
B.8.3.3 Vasos de precipitados de 100 mL.
B.8.3.4 Pipetas volumétricas de 50 mL.
B.8.3.5 Pipetas graduadas de 10 mL.
B.8.3.6 Auxiliar de macropipeteado.
B.8.3.7 Jeringas de vidrio o desechables de
50 mL.
B.8.3.8 Micropipetas de 10 a 100 µL; 100 a
1000 µL. y 1 a 5 mL.
B.8.3.9 Puntas para micropipeta.
B.8.3.10 Filtros para solventes orgánicos de
47 mm de diámetro y poro de 0,45 µm.
B.8.3.11 Filtros para solventes acuosos de
47 mm de diámetro y poro de 0,2 µm.
B.8.3.12 Filtros para muestras de
politetrafluoretileno de 13 mm y poro de 0,45 µm.
B.8.3.13 Matraces aforados color ámbar de 5,
25 y 100 mL.
B.8.3.14 Jeringas desechables de 5 mL sin
aguja.
B.8.3.15 Frascos vial color ámbar de 5 mL
con tapón.
B.8.3.16 Matraces Erlenmeyer de 250 mL.
B.8.3.17 Celdas de cuarzo para
espectofotómetro de 1 cm de paso de luz.
B.8.3.18 Pipetas Pasteur.
B.8.3.19 Papel filtro Whatman No. 4 o
equivalente.
B.8.3.20 Adaptadores o acoples de
apilamiento para unir columnas de inmunoafinidad (adaptors starcking 1,3 or 5
mL part Nª 5185-57-94 Agilent o similar)
B.8.3.21 Embudos
B.8.4
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser de grado analítico y por agua debe entenderse agua
estilada.
B.8.4.1
Acetonitrilo ( C2H3N) grado HPLC.
B.8.4.2
2-Propanol (isopropanol) grado HPLC.
B.8.4.3
Agua (H2O)
destilada y grado HPLC.
B.8.4.4
Acido sulfúrico concentrado (H2SO4).
B.8.4.5
Patrón certificado de 50 mg AFM1
en película.
B.8.4.6
Tripsina (proteasa pancreática), 2000 FIP-U/g.
B.8.4.7
Dicromato de potasio (K2Cr2O7).
B.8.4.8
Solución de ácido sulfúrico 0,018 N. Disolver 1 mL de ácido sulfúrico
concentrado y aforar a 2 L con agua destilada.
B.8.4.9
Soluciones patrón de dicromato de potasio.
B.8.4.9.1
Aproximadamente 0,25 mM.
Pesar exactamente 78 mg de dicromato de
potasio previamente secado en estufa a 100-105°C durante 2 h, y aforar a 1 L
con ácido sulfúrico 0,018 M.
B.8.4.9.2
Aproximadamente 0,125 mM.
Diluir 25 mL de la solución de 0,25 mM a 50
mL con ácido sulfúrico 0,018 M.
B.8.4.9.3
Aproximadamente 0,0625 mM
Diluir 25 mL de la solución de 0,125 mM a 50
mL con ácido sulfúrico 0,018 M.
B.8.4.10
Fase móvil para HPLC. Agua-Acetonitrilo (75:25). Filtrar a través de
filtro de membrana de 0,45 mm y
degasificar. Es recomendable si el sistema cuenta con una bomba binaria o
cualquier otra, no se realice la mezcla por medio de ésta, debido a la
facilidad con que se generan burbujas
B.8.4.11
Cloruro de sodio
B.8.4.12
Fosfato disódico dihidratado
B.8.4.13
Cloruro de potasio
B.8.4.14
Hidróxido de sodio
B.8.4.15
Solución salina amortiguadora de fosfatos para lavado de columna de
inmunoafinidad (pesar 8 g NaCl, 1,16 g Na2HPO4*2H2O, 0,2g KH2PO4, 0,2g KCl, disolver en 1L de agua destilada y ajustar a pH 7,4 con NaOH
o HCl
B.8.5
Procedimiento.
B.8.5.1
Preparación de la Muestra.
B.8.5.1.1
Productos Líquidos.
Calentar las muestras de leche entre 35
-37ªC en baño de agua termostaizada y a continuación homogenizar suavemente,
con barra magnética para dispersas la grasa. Centrifugar un volumen de muestra
(2000g-15 min) para separar la grasa y eliminar la capa superior. Filtrar la porción
restante del tubo con papel Whatman Nª 4 (o similar) y transferir 50 mL cuantitativamente
medidos al reservorio de la columna de inmunoafinidad, la cual previamente, se
encuentra a temperatura ambiente.
Para el análisis de productos esterilizados,
es recomendable diluir volumen a volumen con agua destilada previo
calentamiento y filtración o produco preparado. Para el análisis de productos
esterilizados, es recomendable diluir volumen a volumen con agua destilada
previo al calentamiento y filtración o centrifugación.
B.8.5.1.2
Productos Deshidratados.
Reconstituir con agua de acuerdo con las
instrucciones señaladas en la etiqueta o 130 g del producto llevados a 1 L con
agua a 50ºC. Disolver y agitar la muestra a fin de homogeneizarla por completo.
Colectar al menos 50 mL de la leche preparada.
Nota: Para el análisis de caseinatos de
sodio, calcio y potasio, es necesario efectuar una hidrólisis enzimática de la
porción de prueba previo a la filtración o centrifugación. Para este propósito,
proceder de igual forma que con los productos deshidratados, pero adicionando 2
g de tripsina a la porción de prueba antes de colocar el matraz en el baño de
agua por 30 minutos.
B.8.5.2
Calibración del Espectrofotómetro:
B.8.5.2.1
Determinar la absorbancia (A) de las tres soluciones de K2Cr2O7 0,25, 0,125 y
0,0625 mM en ácido sulfúrico, a su máximo de absorción cerca de 350 nm, usando
como blanco la solución de ácido sulfúrico 0,018 N.
B.8.5.2.2
Calcular la absorbitividad molar (e) de cada concentración con la siguiente fórmula:
(e)= A x 1000 Conc. (mM)
B.8.5.2.3
Si los tres valores varían, revisar la técnica o el instrumento,
promediar los 3 valores para obtener el valor de (e).
B.8.5.2.4
Determinar el factor de corrección (FC) para cada instrumento y celdas
en particular, sustituyendo en la siguiente ecuación:
FC= 3160
(e)
Donde: 3160 =
Valor de (e) de
las soluciones de K2Cr2O7
B.8.5.2.5 Si el valor de FC
es < 0,95 o > 1,05 revisar el instrumento o técnicas, para determinar o
eliminar la causa (usar el mismo juego de celdas en la calibración y
determinación de la pureza).
B.8.5.3 Preparación de Soluciones Patrón de
AFM1.
B.8.5.3.1 Solución Patrón de 2 ng/mL.
B.8.5.3.1.1 Por medio de una
jeringa, introducir aproximadamente 2 mL de acetonitrilo dentro del vial
sellado que contiene el patrón certificado de AFM1.
Agitar vigorosamente durante 1 minuto en mezclador tipo vórtex y transferir
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 25 mL usando pequeñas porciones de
acetonitrilo. Diluir al volumen con acetonitrilo y mezclar bien.
B.8.5.3.1.2 Transferir una
alícuota de 2-3 mL de esta solución a una celda de cuarzo y registrar el
espectro ultravioleta entre 330 y 370 nm, usando acetonitrilo en la celda de
referencia. Medir la absorbancia de la solución a la longitud de onda de máxima
absorción (la cual es cercana a 325 nm). Determinar la concentración exacta de
esta solución empleando la siguiente ecuación:
En donde:
A= absorbancia a
350 nm.
PM= Peso molecular
para AFM1= 328.
e = coeficiente de extinción para AFM1=
19,850.
FC= Factor de
corrección (calculado en B.9.5.2.4).
B.8.5.3.1.3 Regresar la
solución de AFM1 al frasco original. Almacenar esta solución
en el congelador por un máximo de 2 años, pero verificar su concentración cada
6 meses. Antes de usar esta solución permitir que alcance la temperatura
ambiente. Debe mantenerse lejos de la luz directa
B.8.5.3.2 Solución Patrón de 0,5 mg/mL.
Medir un volumen
apropiado de solución patrón (B.8.5.3.1.) en un matraz volumétrico de 5 mL,
dado que se transfieran exactamente 500 mg de AFM1.
Diluir al volumen con acetonitrilo y mezclar vigorosamente en vortex. Esta
solución es estable por 2 meses si es almacenada en refrigeración (4ºC).
B.8.5.3.3 Soluciones Patrón de Trabajo.
Preparar una serie
de soluciones estándares calibrantes con el objeto de inyectar masas de
aflatoxina M1 de 0,5, 1,0, 5,0 y 10 ng cada una presente en 50 mL de inyección
AFM1. Para ello medir el volumen apropiado de solución (B.8.5.3.2) en un vial
color ámbar y evaporar, con flujo de nitrógeno. Diluir al volumen necesario con
fase móvil del inciso 8.4.10. Preparándose en el día de su uso.
B.8.5.4 Extracción de la AFM1 por medio de Columnas de Inmunoafinidad.
B.8.5.4.1 Firmemente
conectar una columna de inmunoafinidad a la punta de una jeringa de vidrio o
desechable utilizada como reservorio por medio de acoples y colocar en el
extractor de fase sólida (manifold de vacío).
B.8.5.4.2 Medir 50 mL de la
muestra en el depósito de la jeringa y pasarla a través de la columna de
inmunoafinidad a un flujo aproximado de 2-3 mL/min.
B.8.5.4.3 Lavar la columna
con 20 mL de buffer a un flujo aproximado de 2-3 mL/min. Descartar los lavados.
Pasar de 2-3 mL de aire o suave flujo de nitrógeno para secar el material de
empaque.
B.8.5.4.4 Eluir lentamente
la aflatoxina con 4mL de acetonitrilo. Dejar el acetonitrilo en contacto con la
columna por lo menos 3 minutos para asegurar la completa remoción de la toxina
ligada. Esto se logra reflujando el acetonitrilo de dos a tres veces. Colectar
el eluido en un vial de 5 mL.
B.8.5.4.5
Evaporar a sequedad a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. Adicionar al
residuo 200 L de fase móvil (B.8.4.10). Agitar y filtrar a través de un filtro
de membrana de 0,45 mm y
proceder con la cuantificación por HPLC.
B.8.5.5
Cuantificación por HPLC.
B.8.5.5.1
Encender todos los componentes del sistema de cromatografía.
B.8.5.5.2
Fijar los siguientes parámetros cromatográficos de acuerdo con las
instrucciones de operación del equipo:
|
Fase móvil: |
Agua:Acetonitrilo
(B.8.4.10). |
|
Flujo: |
0,8 mL/min. |
|
Volumen de
inyección: |
50 mL (equivalente a
12,5 mL de producto fluido o 1,25 g de producto deshidratado). |
|
Detector de
fluorescencia |
Excitación: 365 nm. Emisión: 435 nm. |
B.8.5.5.3 Purgar las bombas
del sistema con cada uno de los componentes de la fase móvil.
B.8.5.5.4 Correr la fase
móvil a través de todo el sistema a un flujo de 0,8mL/min, hasta obtener una
línea base estable.
B.8.5.5.5 Inyectar 50 mL de la solución
de trabajo de AFM1
de la mayor concentración (B.8.5.3.2) y ajustar los controles del
detector de fluorescencia para dar al menos un 80% de respuesta del
registrador. Repetir las inyecciones 2-3 veces hasta que las áreas del pico son
constantes. La aflatoxina eluye en un tiempo aproximado de 11 minutos.
B.8.5.5.6 El día del
análisis, inyectar en secuencia, volúmenes de 50 mL de cada solución patrón de trabajo y preparar una
curva de calibración graficando el área del pico contra la concentración de AFM1 inyectada.
Ajustar la curva por método de mínimos cuadrados (Regresión Lineal).
B.8.5.5.7 Inyectar del mismo
modo 50 mL de
cada una de las muestras y determinar la cantidad de AFM1 en la muestra
utilizando la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración como
sigue:
Y = m x + b
En
donde:
Y =
Area del pico correspondiente a la AFM1 en la muestra.
m =
pendiente.
x =
concentración en ng/mL de
AFM1 en la
muestra.
b =
ordenada al origen.
Despejar
x, para obtener los ng/mL de
AFM1 en la
muestra.
X=
concentración en ng de AFM1 en la muestra.
Despejar
X, para obtener los ng de AFM1 en la muestra
B.8.5.5.8 Si el área del
pico obtenido para la muestra es mayor que la obtenida para la solución patrón
de la mayor concentración, preparar una solución adecuada diluyendo con Fase
móvil B.8.4.10 y volver a inyectar.
B.8.5.6 Determinación de la Eficiencia de
las Columnas de Inmunoafinidad.
B.8.5.6.1 Realizar los
cálculos necesarios para la fortificación de una muestra por triplicado, con el
punto medio de la curva y prosiguiendo como describe B.8.5.4.2 a B.8.5.4.5.
B.8.5.6.2 Eluir la AFM1 con 4 mL de
acetonitrilo y evaporar a sequedad a 40ºC con la ayuda de nitrógeno.
Reconstituir con 1 mL de agua acetonitrilo (7:3).
B.8.5.6.3 Inyectar 50 mL al sistema HPLC
bajo las condiciones descritas anteriormente. El lote de columnas de
inmunoafinidad es adecuado si la recuperación de AFM1 es > 80%.
B.8.6 Cálculos:
Calcular la concentración de AFM1 en la
porción de prueba, usando las siguientes fórmulas:
Esta fórmula es aplicable sólo cuando
ninguna dilución ha sido efectuada. El factor de dilución correspondiente debe
ser tomado en cuenta (por ejemplo en el análisis de productos esterilizados o
cuando la muestra se sale del intervalo de la curva de calibración).
B.8.7
Expresión de Resultados.
|
mg de
AFM1 /L |
B.8.6
Preparación y Dilución de Muestras para su Análisis Microbiológico.
B.9.1
Fundamento
Se basa en la preparación de diluciones
primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible de los
microorganismos presentes en la porción de muestra.
B.9.2
Materiales y Equipo
B.9.2.1 Pipetas bacteriológicas para
distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón de algodón.
Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su
volumen total.
B.9.2.2 Frascos de vidrio de 250 mL con
tapón de rosca.
B.9.2.3 Tubos de 16 x 150 mm con tapón de
rosca.
B.9.2.4 Utensilios esterilizables para la
obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
B.9.2.5 Todo el material e instrumentos que
tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o Autoclave, durante 15 minutos
como mínimo a 121 ± 1,0°C.
B.9.2.6 El material de vidrio puede
sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida
y éste debe ser químicamente inerte.
B.9.2.7 Horno para esterilizar que alcance
una temperatura mínima de 170°C.
B.9.2.8 Autoclave con termómetro y
manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
B.9.2.9 Baño de agua con control de
temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con
divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.
B.9.2.10 Licuadora de una o dos velocidades
controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
B.9.2.11 Vasos para licuadora con tapa
esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
B.9.2.12 Balanza granataria con sensibilidad
de 0,1 g
B.9.2.13 Vórtex para la agitación de las
diluciones.
B.9.2.14 Perilla.
B.9.2.15 Frascos de vidrio con capacidad de
125 a 250 mL.
B.9.3
Reactivos
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe entenderse
como agua destilada.
B.9.3.1
Solución de Hidróxido de Sodio 1,0 N
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Hidróxido de sodio |
4,0 g |
|
Agua |
100 mL |
Preparación:
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a
100 mL con agua.
B.9.3.2
Soluciones Diluyentes
B.9.3.2.1
Solución Reguladora de Fosfatos (solución concentrada).
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Fosfato de sodio monobásico |
34,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y
ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0N. Llevar a un litro
con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C. Conservar en
refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 mL de la solución concentrada
y llevar a un litro con agua (solución de trabajo). Distribuir en porciones de
99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de
trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
B.9.3.2.2
Agua Peptonada
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona |
1,0 g |
|
Cloruro de sodio |
8,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de
agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0N. Distribuir en
porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se
requiera. Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos. Después de la
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán
ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente,
almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no
mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
B.9.4
Procedimiento
B.9.4.1
Preparación de la Dilución Primaria.
B.9.4.1.1
A partir de muestras líquidas:
Para muestras líquidas no viscosas en las
cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente
homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).
Para muestras congeladas de un alimento
originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a
45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente puede
utilizarse el Vortex.
Para la parte líquida de una muestra
heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la
muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
B.9.4.1.1.1
Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un
arco de 30cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y
diluir con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura
similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Considerar
el uso de vórtex para la agitación de los tubos.
B.9.4.1.1.2
Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores,
por ejemplo volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma
que se describió anteriormente.
B.9.4.1.2
A partir de muestras sólidas o semisólidas.
B.9.4.1.2.1
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en
refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de
proceder a su análisis.
B.9.4.1.2.2
Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un
recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.
B.9.4.1.2.3
Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una
temperatura similar a la de la muestra.
B.9.4.1.2.4
Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos
hasta obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la
técnica correspondiente para cada alimento. Aun en los equipos más lentos, este
tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.
B.9.4.1.2.5
Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la
cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensión. Cuando la
dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual
debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de
resultados. El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado
para algunos productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o
constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo cuando
exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados
obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
B.9.4.2
Preparación de las Diluciones Decimales Adicionales.
B.9.4.2.1
Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución
primaria 1 + 9 (10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen
del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la
pipeta y el diluyente.
B.9.4.2.2
Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma
manera que se describe en B.9.4.1.1.1.
B.9.4.2.3
La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que
se van a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la
muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que
se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total
de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
B.9.4.2.4
Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando
simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se
transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
B.9.4.2.5
Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido
equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una
sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.
B.9.4.2.6
Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe
apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición
vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.
En estudios donde se busca la presencia o
ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 mL o 0,1 g, no es
necesario preparar diluciones mayores.
El criterio para seleccionar las diluciones
a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es:
Para la técnica del número más probable
utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 mL de
la dilución más alta.
Para la técnica de cuenta en placa,
considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un
mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias
en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número
especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.
B.9.4.3
Duración del Procedimiento.
En general, las diluciones de la muestra
deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas
para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su
preparación.
B.10
Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa.
B.10.1 Fundamento del método
El método permite determinar el número de
microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio
selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C
en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos
orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
B.10.2 Materiales
B.10.2.1 Pipetas bacteriológicas para
distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de algodón.
Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su
volumen total.
B.10.2.2 Frascos de vidrio de 250 mL con
tapón de rosca.
B.10.2.3 Tubos de 16 X 150 mm con tapón de
rosca.
B.10.2.4 Utensilios esterilizables para la
obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
B.10.2.5 Cajas Petri.
B.10.2.6 Todo el material e instrumentos que
tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante 15
minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
B.10.2.7 El material de vidrio puede
sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones
repetidas y éste debe ser químicamente inerte.
B.10.3 Aparatos e instrumentos
B.10.3.1 Horno para esterilizar que alcance
una temperatura mínima de 170°C.
B.10.3.2 Autoclave con termómetro y
manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
B.10.3.3 Baño de agua con control de
temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con
divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
B.10.3.4 Licuadora de una o dos velocidades
controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
B.10.3.5 Vasos para licuadora con tapa
esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
B.10.3.6 Incubadora con termostato que evite
variaciones mayores de ± 1,0° C, provista con termómetro calibrado.
B.10.3.7 Contador de colonias de campo
oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
B.10.3.8 Registrador mecánico o electrónico.
B.10.3.9 Microscopio óptico.
B.10.3.10 Potenciómetro con una escala
mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
B.10.4 Reactivos
Los reactivos que a continuación se
mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse
como agua destilada.
B.10.4.1 Soluciones Diluyentes
B.10.4.1.1
Solución Reguladora de Fosfatos (solución concentrada)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Fosfato monopotásico |
34,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y
ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0N. Llevar con agua a
un litro. Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos. Conservar en
refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y
llevar a un litro con agua (solución de trabajo). Distribuir en porciones de
99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0°C.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de
trabajo deben ser iguales a los iniciales.
B.10.4.1.2
Agua Peptonada
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona |
1,0 g |
|
NaCl |
8,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de
agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones
de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Después de la esterilización, los
volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado
inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por
un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o
composición.
B.10.4.2
Medio de Cultivo Agar-rojo-violeta-bilis-lactosa (RVBA)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona |
7,0 g |
|
Extracto de levadura |
3,0 g |
|
Lactosa |
10,0 g |
|
Sales biliares |
1,5 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Rojo neutro |
0,03 g |
|
Cristal violeta |
0,002 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Mezclar los componentes en el agua y dejar
reposar durante algunos minutos. Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4
con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma que
después del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con agitación
constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un
baño de agua hasta que llegue a 45°C. Evitar el sobrecalentamiento del medio.
No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras
horas después de su preparación. En el caso de utilizar medio de cultivo
deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.
B.10.5
Preparación de la Muestra
La preparación de la muestra debe ser de
acuerdo a lo establecido en el numeral 9 de este apéndice normativo.
B.10.6
Procedimiento
B.10.6.1
Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra líquida directa o de la
dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
B.10.6.2
Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera
sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
B.10.6.3 Vertir
de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua.
En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del
medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el
momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
B.10.6.4
Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha
a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis
movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de
atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la
mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie
horizontal fría.
B.10.6.5
Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad.
Incluír un control adicional que considere la esterilidad de la solución
diluyente adicionando 1 mL directo de esta solución en el mismo medio de
cultivo.
B.10.6.6
Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter
aproximadamente 4 mL del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio
inoculado. Dejar que solidifique.
B.10.6.7
Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.
B.10.6.8
Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el
contador de colonias.
B.10.6.9 Seleccionar las
placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación
debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la
morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a
2,0 mm.
B.10.6.10 Para el caso de
polvos, inocular 5 placas con 2 mL de la dilución 1:10, contar las colonias
encontradas en cada placa y reportar la suma de UFC/g
B.10.7 Expresión de los Resultados
B.10.7.1 Cálculo del Método
B.10.7.1.1 Placas que contienen
entre 15 y 150 colonias características.
Separar
las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características
en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el
número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el
número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los
criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias
en Placa.
B.10.7.1.2 Placas que
contienen menos de 15 colonias características.
Si cada
una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el
número obtenido seguido de la dilución correspondiente.
B.10.7.1.3 Placas con
colonias no características.
Si en
las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos
de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.
B.10.8 Informe de la Prueba
Informar:
UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2
h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando
como referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En
caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no
desarrollo de coliformes por mL.
B.11 Determinación de Staphylococcus aureus
B.11.1 Fundamento
Este
método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efectúa directamente en
placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación
mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este método es adecuado para
el análisis de alimentos en los cuales se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus por g.
B.11.2 Materiales y Equipo
Todos
los instrumentos que se utilicen para trabajar la muestra deben esterilizarse
mediante horno, durante 2 h de 170-175ºC o como alternativa en autoclave
durante 15 min como mínimo a 121ºC ±1.
B.11.2.1
Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas y separador de huevo.
B.11.2.2
Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 125 a 250 mL de capacidad, con
tapón de rosca.
B.11.2.3
Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm, con tapón de rosca.
B.11.2.4
Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro.
B.11.2.5
Pipetas bacteriológicas de 1 mL y 10 mL de capacidad graduadas en 0,1 mL y 1 mL
respectivamente y diámetro de 2 a 3 mm.
B.11.2.6
Pipetas Pasteur.
B.11.2.7
Probetas.
B.11.2.8
Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm de largo
dobladas en ángulo recto, o varillas de plástico estériles desechables.
B.11.2.9
Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio
B.11.2.10
Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de
vidrio en forma de "V" rodeada de algodón humedecido con agua.
B.11.2.11
Horno para esterilizar que alcance 180°C.
B.11.2.12
Autoclave con termómetro.
B.11.2.13
Baño de agua con regulador de temperatura de 35 ± 0,5ºC.
B.11.2.14
Baño de agua con regulador de temperatura de 45 ± 0,5ºC.
B.11.2.15
Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensibilidad de 0,1 g.
B.11.2.16
Incubadora a 35 ± 1ºC.
B.11.3 Reactivos
En caso
de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, para su preparación se
deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva.
Cuando
se mencione agua debe entenderse que se trata de "agua destilada".
Los
reactivos a emplear en el método objeto de esta norma deben ser grado
analítico.
B.11.3.1 Soluciones Diluyentes
B.11.3.1.1
Solución Reguladora de Fosfatos (Solución concentrada)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Fosfato
monopotásico |
34,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y
ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1N, aforar con agua a 1
l. Esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1, conservar en refrigeración (solución
concentrada). Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1 l con agua
(solución de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se
requiera. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Después de la esterilización,
los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los
iniciales.
B.11.3.1.2
Agua Peptonada
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona |
1,0 g |
|
Cloruro de sodio |
8,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver los componentes en un litro de
agua. Ajustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio 1N. Distribuir en
porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15
min. Después de la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución
de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
B.11.3.2
Medios de Cultivo
B.11.3.2.1
Medio de Baird-Parker
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Medio base
(11.3.2.2) |
95,0 mL |
|
Solución de
telurito de potasio (11.3.2.3) |
1,0 mL |
|
Emulsión de yema
de huevo (11.3.2.4) |
5,0 mL |
Preparación
Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar
los demás ingredientes y mezclar. Colocar de 15 a 20 mL del medio completo,
enfriar y dejar solidificar. Las placas pueden almacenarse por 48 h a
temperatura de 0 a 5ºC.
B.11.3.2.2
Medio base de Baird-Parker
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Triptona |
10,0 g |
|
Extracto de
levadura |
1,0 g |
|
Extracto de
carne |
5,0 g |
|
Glicina |
12,0 g |
|
Cloruro de litio |
5,0 g |
|
Piruvato de
sodio |
10,0 g |
|
Agar |
20,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver los ingredientes o el agar base en
agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1 min. Esterilizar a
121ºC ±1 durante 15 min. Enfriar y mantener el medio a 45ºC.
En el caso de usar medio base deshidratado,
seguir las indicaciones del fabricante.
B.11.3.2.3
Solución de Telurito
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Telurito de
potasio |
1,0 g |
|
Agua |
100,0 mL |
Preparación
Disolver el telurito de potasio en agua y
esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios meses a temperatura de
0 a 5ºC.
B.11.3.2.4
Emulsión de Yema de huevo
Preparación
Lavar con agua y jabón los huevos frescos
que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura de yodo (solución
alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000).
Enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril. En campana de flujo laminar
o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de
claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 mL y
completar a 90 mL con solución salina isotónica. Verter la emulsión a un matraz
Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fuertemente para formar la emulsión.
Filtrar a través de gasa. Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h
siguientes a su preparación.
B.11.3.2.5
Solución Salina fisiológica
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Cloruro de sodio |
0,85 g |
|
Agua |
100,0 mLl |
Preparación
Disolver el ingrediente en agua y
esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min.
B.11.3.2.6
Caldo de Infusión cerebro-corazón (BHI)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Infusión de cerebro de ternera |
200,0 mL |
|
Infusión de corazón de res |
250,0 mL |
|
Peptona de gelatina |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Fosfato disódico dodecahidratado |
2,5 g |
|
Glucosa |
2,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua y calentar
ligeramente si es necesario. Distribuir y esterilizar durante 15 min a 121ºC
±1.
B.11.3.2.7
Acido Desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera o equivalente |
0,03 g |
|
Agar |
1,00 g |
|
Cloruro de calcio anhidro (Solución 0,01 M) (11.3.2.8) |
0,10 mL |
|
Cloruro de sodio |
1,00 g |
|
Azul de toluidina (Solución 0,1 M) (11.3.2.9) |
0,30 mL |
|
Tris-(hidroximetil-aminometano) (Tris solución 0,05 M, pH 9) (11.3.2.10) |
100,00 mL |
Preparación
Disolver
los ingredientes, excepto el azul de toluidina agitando hasta completar la
disolución del ácido desoxirribonucleico y calentar a ebullición. Agregar el
azul de toluidina. Distribuir en frascos pequeños con tapón de hule. No es
necesario esterilizar. Este medio es estable a temperatura ambiente hasta 4
meses y funciona perfectamente aun después de fundirlo varias veces. Tomar un
porta objetos limpio y agregar 3 mL del medio fundido esparciéndolo por la
superficie. Cuando el agar solidifique, hacer orificios con la punta de una
pipeta Pasteur. Conservar en refrigeración para evitar la deshidratación.
B.11.3.2.8 Solución de Cloruro de calcio
anhidro 0,01 M
Cloruro
de calcio PM = 110,99
Disolver
0,1199 g de cloruro de calcio en 100 mL de agua.
B.11.3.2.9
Solución de Azul de toluidina 0,1 M
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100
mL de agua.
B.11.3.2.10
Solución Amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilaminometano)
(Tris pH 9) PM = 121,1
Disolver 6,055 g de Tris en 100 mL de agua.
B.11.3.2.11
Reactivo Biológico: Plasma de conejo
Emplear plasma de conejo deshidratado o
rehidratado siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar ácido
etilendiaminotetracético (EDTA) en solución al 0,1% en plasma rehidratado. Si
se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3.
Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse
sangre citratada.
B.11.4
Preparación de la Muestra
La preparación de la muestra debe ser de
acuerdo a lo establecido en el numeral 9 de este apéndice normativo.
B.11.5
Procedimiento
B.11.5.1
Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dilución, depositar 0,1 mL
sobre la superficie de las placas de agar Baird-Parker.
B.11.5.2
Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de
vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada dilución.
B.11.5.3
Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el
agar.
B.11.5.4
Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC.
B.11.5.5
Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus; si no es posible,
seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de
150 colonias.
B.11.5.6 Cuando
las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y
al informe se debe agregar la nota de "valor estimado".
B.11.5.7 Las
colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de
diámetro de 1 a 2mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la
colonia.
B.11.5.8
Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las
pruebas de coagulasa y termonucleasa:
CUADRO
|
NUMERO DE COLONIAS SOSPECHOSAS EN PLACA |
NUMERO DE COLONIAS POR PROBAR |
|
Menos de 50 |
3 |
|
51 a 100 |
5 |
|
101 a 150 o más |
7 |
|
< 3 |
Probarlas Todas |
B.11.5.9
Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 mL de
caldo de infusión cerebro-corazón.
B.11.5.10
Incubar a 35ºC durante 24 h.
B.11.5.11
Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus
epidermidis como testigos positivo y negativo.
B.11.5.12
Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0,3 mL de cada
cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de
termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa.
B.11.5.13
Prueba de Coagulasa
B.11.5.13.1
Agregar a los 0,2 mL del cultivo anterior, 0,2 mL de plasma de conejo diluido
volumen a volumen con solución salina estéril.
B.11.5.13.2
Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1
h; si no hay formación de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la
prueba si hay formación de coágulo.
B.11.5.13.3 Para
comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade una gota de cloruro
de calcio al 5% a 0,5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un
coágulo en 10-15 seg.
B.11.5.14
Prueba de Termonucleasa
B.11.5.14.1
Calentar durante 15 min, 0,3 mL de cultivo en caldo de infusión cerebro-corazón
en baño de agua hirviendo.
B.11.5.14.2 Pasar
una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del
medio, incluye testigo.
B.11.5.14.3
Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h.
B.11.5.14.4 La
aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la
perforación se califica como positiva.
B.11.6
Cálculo
Hacer el cálculo del contenido de
microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de colonias totales,
el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 mL).
Ejemplo 1:
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución
1:1000
Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas
dan 4 positivas, el cálculo es:
Ejemplo 2:
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución
1:10
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas
dan 2 positivas, el cálculo es:
B.11.7
Expresión de los Resultados
Según ejemplo 1:
Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g
Según ejemplo 2:
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado
Si las pruebas confirmativas resultan
negativas en todas las colonias probadas, informar como:
0 UFC/g en muestras directas
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100
En la práctica los resultados pueden variar,
esto dependerá del técnico que trabaje el método y el grado de confiabilidad
del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ± 52%.
B.12
Determinación de Salmonella spp.
B.12.1
Fundamento
La presente técnica para la detección de Salmonella spp. en alimentos, describe
un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
Preenriquecimiento, es el paso donde la
muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite
restaurar las células de Salmonella dañadas
a una condición fisiológica estable.
Enriquecimiento selectivo, empleado con el
propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella
spp. e inhibir otros organismos presentes en la muestra.
Selección en medios sólidos, en este paso se
utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros
diferentes a Salmonella spp. y permite el reconocimiento visual de
colonias sospechosas.
Identificación bioquímica, este paso permite
la identificación genérica de los cultivos de Salmonella spp. y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.
Serotipificación, es una técnica serológica
que permite la identificación específica de un cultivo.
B.12.2
Materiales y Equipo
B.12.2.1
Horno para esterilizar que alcance los 180ºC
B.12.2.2
Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1ºC y
termómetro
B.12.2.3
Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas
B.12.2.4
Baño maría con termostato y termómetro
B.12.2.5
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g, o Balanza de precisión o
analítica
B.12.2.6
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con
vasos esterilizables (vidrio o aluminio)
B.12.2.7
Mecheros Bunsen o Fisher
B.12.2.8
Potenciómetro
B.12.2.9
Matraces Erlenmeyer de 500 mL
B.12.2.10
Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las
muestras simples y compuestas
B.12.2.11
Angulos de vidrio
B.12.2.12
Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas
B.12.2.13
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm
B.12.2.14
Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm
B.12.2.15
Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 mL, graduadas en 0,1 mL y
protegidas con tapón de algodón
B.12.2.16
Pipetas de 1 mL , con graduaciones de 0,01 mL.
B.12.2.17
Cajas de petri estériles de vidrio o desechables
B.12.2.18
Rejillas para tubos de ensaye
B.12.2.19
Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3
mm de diámetro
B.12.2.20
Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de
pH para cambios de color
B.12.2.21
Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe
esterilizarse mediante: Horno, durante 2 horas a 170-175ºC o autoclave, durante
15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC
B.12.2.22
Perilla
B.12.2.23
Vórtex
B.12.2.24
Estomacher (opcional)
B.12.3
Reactivos
En caso de disponerse de fórmulas
comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la
etiqueta respectiva para su preparación.
Las sustancias químicas usadas para preparar
los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.
B.12.3.1
Medios de Pre-enriquecimiento
B.12.3.1.1
Agua de Peptona tamponada
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona |
10,0 g |
|
Cloruro sódico |
5,0 g |
|
Fosfato sódico dibásico |
3,5 g |
|
Fosfato potásico monobásico |
1,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver los componentes en agua, calentando
si es necesario. Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a
7,0. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad
necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba. Esterilizar por
20 min a 121 ± 1ºC.
B.12.3.1.2
Caldo Lactosado
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de carne |
3,0 g |
|
Peptona |
5,0 g |
|
Lactosa |
5,0 g |
|
Agua destilada pH final: 6,9 ± 0,2 |
1,0 l |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua, calentando
a 65ºC. Distribuir en porciones de 225 mL, en frascos de 500 mL. Esterilizar
durante 15 min a 121ºC ± 1ºC.
B.12.3.2
Caldo de Enriquecimiento
B.12.3.2.1
Caldo Selenito-cistina
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Triptona o polipeptona |
5,00 g |
|
Lactosa |
4,00 g |
|
Fosfato disódico |
10,00 g |
|
Selenito ácido de sodio |
4,00 g |
|
L-cistina |
0,01 g |
|
Agua destilada pH final: 7,0 ± 0,2 a 25ºC |
1,00 l |
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de
agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en recipientes
estériles, según se requiera. El caldo así preparado es transparente. De
preferencia usarlo el mismo día de su preparación. Si se desea conservar el
medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110ºC
± 1ºC, tomando entonces un color salmón.
B.12.3.2.2
Caldo Tetrationato
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Proteosa peptona o triptona |
5,0 g |
|
Sales biliares |
1,0 g |
|
Carbonato de calcio |
10,0 g |
|
Tiosulfato de sodio pentahidratado |
30,0 g |
|
Agua destilada pH final: 7,0 ± 0,1 |
1,0 l |
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de
agua destilada estéril. Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10
y 225 mL, en recipientes estériles. Guardar en refrigeración. Antes de usar el
medio, agregar 2 mL de una solución yodo-yoduro y 1 mL de solución de verde
brillante al 0,1% por cada 100 mL de caldo. El medio una vez adicionado de yodo
no debe calentarse y debe usarse el mismo día de su preparación
B.12.3.2.3
Vassiliadis-Rappaport
Solución
A
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Triptona |
5,0 g |
|
Cloruro de sodio |
8,0 g |
|
Fosfato de potasio dihidrogenado |
1,6 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
Disolver los componentes en agua por
calentamiento cercano a 70ºC.
Solución
B
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Cloruro de magnesio hexahidratado |
400,0 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
Disolver el cloruro de magnesio en agua.
Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero
de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de tal modo
que la concentración de la solución sea de 0,4 g/mL. Conservar en frasco ámbar
a temperatura ambiente.
Solución
C
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Oxalato de verde de malaquita |
0,4 g |
|
Agua destilada |
100,0 mL |
Disolver el oxalato de verde de malaquita en
agua. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.
Medio
completo
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
solución A |
1000 mL |
|
solución B |
100 mL |
|
solución C |
10 mL |
Preparación
Adicionar 1000 mL de la solución A, 100 mL
de la solución B y 10 mL de la solución C. Ajustar el pH si es necesario, de
tal manera que después de la esterilización sea de 5,2. Distribuir antes de
usar dentro de tubos en cantidades de 10 mL. Almacenar en refrigeración.
B.12.3.2.4
Caldo de Soya tripticasa
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Tripticasa o
triptosa |
17,0 g |
|
Fitona |
3,0 g |
|
Glucosa |
2,5 g |
|
Cloruro de sodio |
2,5 g |
|
Agua destilada pH final: 7,3 ±
0,2 |
1,0 l |
Preparación
Disolver
los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su
disolución completa. Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces de 500
mL y esterilizar en autoclave durante 15 min a 121ºC ± 1ºC.
B.12.3.2.5 Leche descremada reconstituida
Suspender
100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar
circularmente hasta disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en matraces
Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC por 15 min. El volumen final
debe corregirse para mantener 225 mL.
B.12.3.2.6 Caldo Soya tripticasa estéril
adicionado con sulfito de potasio
Adicionar
al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 mL de medio,
quedando una concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adicionar el
sulfito de potasio antes de esterilizar en autoclave en la forma habitual.
B.12.3.3 Medios de Aislamiento
B.12.3.3.1 Agar verde brillante (VB)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de
levadura |
3,0000 g |
|
Polipeptona
(Proteosa peptona No. 3) |
10,0000 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0000 g |
|
Lactosa |
10,0000 g |
|
Sacarosa |
10,0000 g |
|
Rojo de fenol |
0,0800 g |
|
Agar |
20,0000 g |
|
Verde brillante |
0,0125 g |
|
Agua destilada pH final: 6,9 ±
0,2 |
1,0000 l |
Preparación
Suspender
los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta
disolución completa. Ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121ºC
± 1ºC. El sobrecalentamiento del medio disminuye su selectividad. Enfriar el
medio a 50ºC y distribuirlo en cajas de petri estériles. El aspecto del medio
es obscuro, de color marrón.
B.12.3.3.2 Agar con sulfito de bismuto
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de
carne de res |
5,000 g |
|
Mezcla de
peptonas |
10,000 g |
|
Glucosa |
5,000 g |
|
Fosfato disódico
(anhidro) |
5,000 g |
|
Sulfato ferroso
(anhidro) |
0,300 g |
|
Sulfito de
bismuto |
8,000 g |
|
Verde brillante |
0,025 g |
|
Agar |
20,000 g |
|
Agua destilada pH final: 7,6 ±
0,2 |
1,000 l |
Preparación
Suspender
los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolución completa,
agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45ºC y verter en cajas de
petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del
medio. El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben usarse
el mismo día de su preparación. Si la coloración es parda, no deben utilizarse.
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su
selectividad.
B.12.3.3.3 Agar xilosa lisina desoxicolato
(XLD)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Xilosa |
3,75 g |
|
L-lisina |
5,00 g |
|
Lactosa |
7,50 g |
|
Sacarosa |
7,50 g |
|
Cloruro de sodio |
5,00 g |
|
Extracto de
levadura |
3,00 g |
|
Rojo de fenol |
0,08 g |
|
Agar |
15,00 g |
|
Desoxicolato de
sodio |
2,50 g |
|
Citrato férrico-amónico |
0,80 g |
|
Tiosulfato de
sodio |
6,80 g |
|
Agua destilada pH final: 6,9 ±
0,2 |
1,00 l |
Preparación
Suspender
los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a
55ºC, agitando frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH.
Enfriar a 50ºC y verter en cajas de petri estériles. No se esterilice. El
sobrecalentamiento produce una precipitación; la reactividad del medio puede
ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñas. El aspecto del
medio es claro y de color rojo brillante.
B.12.3.3.4 Agar para Salmonella y Shigella
(SS)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de
carne |
5,000 g |
|
Polipeptona |
5,000 g |
|
Lactosa |
10,000 g |
|
Sales biliares |
8,500 g |
|
Citrato de sodio
dihidratado |
8,500 g |
|
Tiosulfato de
sodio pentahidratado |
8,500 g |
|
Citrato férrico |
1,000 g |
|
Agar |
13,500 g |
|
Rojo neutro |
0,025 g |
|
Verde brillante |
0,330 mg |
|
Agua destilada pH final: 7,0 ±
0,2 |
1,000 l |
Preparación
Suspender
los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición
hasta disolución completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. Enfriar
a 50ºC y distribuir en cajas de petri estériles en condiciones asépticas. El
aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.
Nota: La
polipeptona se puede sustituir por 2,5 g de peptona de caseína y 2,5 g de
peptona de carne.
B.12.3.3.5
Agar Entérico Hektoen
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Proteosa peptona |
12,000 g |
|
Extracto de
levadura |
3,000 g |
|
Lactosa |
12,000 g |
|
Sacarosa |
12,000 g |
|
Salicina |
2,000 g |
|
Sales biliares |
9,000 g |
|
Cloruro de sodio |
5,000 g |
|
Tiosulfato de
sodio |
5,000 g |
|
Citrato amónico
férrico |
1,500 g |
|
Azul de
bromotimol |
0,064 g |
|
Fuscina ácida |
0,100 g |
|
Agar |
13,500 g |
|
Agua pH final: 7,5 ±
0,2 |
1,000 l |
Preparación
Suspender
los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa
disolución del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar a 55-60ºC y distribuir en
cajas de petri estériles en condiciones asépticas.
B.12.3.4
Medios para Pruebas Bioquímicas
B.12.3.4.1 Agar de tres azúcares y hierro (TSI)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona de carne |
1,0 g |
|
Peptona de caseína |
1,0 g |
|
Cloruro de sodio |
0,5 g |
|
Lactosa |
1,0 g |
|
Sacarosa |
1,0 g |
|
Glucosa |
0,1 g |
|
Agar |
1,3 g |
|
Rojo de fenol |
2,5 mg |
|
Sulfato ferroso amónico pentahidratado |
20,0 mg |
|
Tiosulfato de sodio |
20,0 mg |
|
Agua destilada pH final: 7,3 ± 0,2 |
100,0 mL |
Preparación
Suspender
los ingredientes en 100 mL de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando
ocasionalmente, hasta disolución completa. Enfriar a 60ºC y ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121ºC ±
1ºC durante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el
fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de
color rojo.
Nota: Las peptonas se pueden sustituir por 2
g de polipeptona.
B.12.3.4.2
Agar de Hierro y Lisina (LIA)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona de gelatina |
0,5 g |
|
Extracto de levadura |
0,3 g |
|
Glucosa |
0,1 g |
|
L-lisina |
1,0 g |
|
Citrato férrico-amónico |
50,0 mg |
|
Tiosulfato de sodio anhidro |
4,0 mg |
|
Púrpura de bromocresol |
2,0 mg |
|
Agar |
1,5 g |
|
Agua destilada pH final: 6,7 ± 0,2 |
100,0 mL |
Preparación
Suspender
los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición
con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca.
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 12 min. Dejar que los tubos se
enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de
4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. El medio ya preparado es de color
púrpura.
B.12.3.4.3
Agar Nutritivo
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de carne |
3,0 g |
|
Peptona |
5,0 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Agua destilada pH final: 6,8 ± 0,2 |
1,0 l |
Preparación
Suspender los ingredientes en agua. Dejar
reposar de 5 a 10 min. Calentar a ebullición hasta disolución completa.
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su volumen.
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar
solidifique.
B.12.3.4.4.
Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de carne |
3,000 g |
|
Peptona |
30,000 g |
|
Hierro peptonizado |
0,200 g |
|
Tiosulfato de sodio |
0,025 g |
|
Agua destilada pH final: 7,3 ± 0,2 |
1,000 l |
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua
destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una
disolución completa. Enfriar a 50ºC y ajustar el pH. Distribuir el medio en
volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ±
1ºC durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en posición vertical.
B.12.3.4.5
Agar Citrato de Simmons
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Fosfato de amonio |
1,00 g |
|
Fosfato dipotásico |
1,00 g |
|
Cloruro de sodio |
5,00 g |
|
Citrato de sodio |
2,00 g |
|
Sulfato de magnesio |
0,20 g |
|
Azul de bromotimol |
0,08 g |
|
Agar |
15,00 g |
|
Agua destilada pH final: 6,8 ± 0,2 |
1,00 l |
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua
destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una
disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en
tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada.
B.12.3.4.6
Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Peptona |
7,0 g |
|
Dextrosa |
5,0 g |
|
Difosfato de potasio |
5,0 g |
|
Agua destilada pH final: 6,9 ± 0,2 |
1,0 l |
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua
destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una
disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en
tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
B.12.3.4.7
Caldo Manitol
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de carne |
1,000 g |
|
Proteosa peptona |
10,000 g |
|
Cloruro de sodio |
5,000 g |
|
Rojo de fenol |
0,018 g |
|
Manitol |
10,000 g |
|
Agua pH final: 7,4 ± 0,2 |
1,000 l |
Preparación
Suspender 26 g del medio deshidratado en un
litro de agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 2 a 3 mL en
tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
B.12.3.4.8
Caldo Malonato
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Extracto de
levadura |
1,000 g |
|
Sulfato de
amonio |
2,000 g |
|
Fosfato
dipotásico |
0,600 g |
|
Fosfato
monopotásico |
0,400 g |
|
Cloruro de sodio |
2,000 g |
|
Malonato |
3,000 g |
|
Glucosa |
0,250 g |
|
Azul de
bromotimol |
0,025 g |
|
Agua pH final: 6,7 ±
0,2 |
1,000 l |
Preparación
Suspender los ingredientes en agua, mezclar
y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 mL.
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
B.12.3.4.9
Caldo Urea
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Urea |
20,00 g |
|
Extracto de
levadura |
0,10 g |
|
Fosfato
monopotásico |
9,10 g |
|
Fosfato disódico |
9,50 g |
|
Rojo de fenol |
0,01 g |
|
Agua pH final: 6,8 ±
0,2 |
1,00 l |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm o en
autoclave de 5 a 8 lb de presión durante 15 min. Distribuir asépticamente de
1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm.
B.12.3.4.10
Caldo de Urea Rápido
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Urea |
20,000 g |
|
Extracto de
levadura |
0,100 g |
|
Fosfato
monopotásico |
0,091 g |
|
Fosfato disódico |
0,095 g |
|
Rojo de fenol |
0,010 g |
|
Agua pH final: 6,8 ±
0,2 |
1,000 l |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm.
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm.
B.12.3.4.11
Caldo Infusión Cerebro Corazón
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Infusión cerebro
corazón |
200,0 g |
|
Infusión de
corazón de res |
250,0 g |
|
Proteosa peptona |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Fosfato disódico
dodecahidratado |
2,5 g |
|
Dextrosa |
2,0 g |
|
Agua destilada pH final: 7,4 ±
0,2 |
1,0 l |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada,
calentar suavemente. Distribuir y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
B.12.3.5
Soluciones
B.12.3.5.1
Solución Verde Brillante al 0,1% (1:1000)
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Verde
brillante |
0,1 g |
|
Agua
destilada estéril |
100,0
mL |
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada estéril hasta
completar 100 mL.
B.12.3.5.2
Solución de Yodo-yoduro
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Cristales
de yodo |
6,0 g |
|
Yoduro
de potasio |
6,0 g |
|
Agua
destilada |
100,0
mL |
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta
completar 100 mL. Conservar en frasco ámbar.
B.12.3.5.3
Solución Salina al 0,85%
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Cloruro
de sodio |
0,85
g |
|
Agua
destilada |
100,00
mL |
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C ± 1°C
durante 15 min.
B.12.3.5.4
Solución Salina formalizada
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Solución
de formaldehído (36-38%) |
6,0
mL |
|
Cloruro
de sodio |
8,5 g |
|
Agua
destilada |
1,0 l |
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada.
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. Enfriar a temperatura ambiente.
Adicionar 6 mL de la solución de formaldehído. No esterilizar después de la
adición de formaldehído.
B.12.3.5.5
Reactivo de Kovac
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
p-dimetil-aminobenzaldehído
5,0 g |
5,0 g |
|
Alcohol
amílico 75,0 mL |
75,0
mL |
|
Acido
clorhídrico concentrado 25,0 mL |
25,0
mL |
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol amílico y después
agregar el ácido clorhídrico lentamente. Conservar en frasco ámbar en
refrigeración.
B.12.3.5.6 Solución
de Alfa-naftol al 5%
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Alfa-naftol |
5,0 g |
|
Alcohol |
100,0
mL |
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta
completar 100 mL.
B.12.3.5.7
Solución de Rojo de metilo
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Rojo de metilo |
0,10 g |
|
Alcohol etílico |
300,00 mL |
|
Agua destilada c.b.p. |
500,00 mL |
Disolver el rojo de metilo en el alcohol
etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL.
B.12.3.5.8
Solución de Hidróxido de potasio al 40%
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Hidróxido de potasio |
40,0 g |
|
Agua destilada |
100,0 mL |
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en
agua hasta completar 100,0 mL.
B.12.3.5.9
Solución de Gelatinasa al 5%
FORMULA
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Gelatinasa |
5,0 g |
|
Agua |
100,0 mL |
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 mL de agua
destilada. NO CALENTAR.
B.12.3.6
Antisueros
Antisuero
polivalente somático (O)
Antisuero
polivalente flagelar (H)
Antisuero
Vi
B.12.4
Procedimiento
B.12.4.1
Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella.
Los siguientes métodos se basan en el
análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de
muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma
proporción. Se recomienda una muestra de 25 g o más.
B.12.4.1.1
Procedimiento general para la preparación de muestras.
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un
vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador
peristáltico (stomacher). Adicionar 225 mL del medio de preenriquecimiento
estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si
es necesario durante un min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a
un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60
min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y
determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8
± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y
cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.
Continuar como se indica en B.12.4.1.2.
B.12.4.1.2
Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto.
B.12.4.1.2.1
Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada.
Seguir el procedimiento general para el
pesado de la muestra y adicionarla lentamente a un matraz Erlenmeyer con 1 lt
de agua estéril, 2 mL al 1% de verde brillante, procurando que el polvo quede
en la superficie del líquido y se hidrate suavemente. De esta solución se toman
225 mL para disolver la muestra. Dejar la mezcla en reposo por 60 min, e
incubar como se indica en B.12.4.1.1.
B.12.4.1.2.2
Queso
Proceder igual que en B.12.4.1.1 utilizando
agua de peptona tamponada como medio de preenriquecimiento.
B.12.4.1.2.3
Productos procesados térmicamente y productos secos.
Se sigue el procedimiento señalado en
B.12.4.1.1 hasta la homogeneización. Si la muestra es en polvo o molida, el
licuado puede omitirse. Después de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como
se indica en el procedimiento general. Para emulsionar las grasas, adicionar
hasta un máximo de 2,25 mL de Tergitol aniónico 7 estéril (121ºC ± 1ºC/15 min)
y mezclar bien. Puede utilizarse Triton X-100 estéril. Usar la cantidad
necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mínimo para que se inicie
la formación de espuma. Puede ser, para el Triton X-100 de 2 a 3 gotas. La
cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del alimento.
Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en polvo.
Incubar las muestras como se indica en B.12.4.1.1
B.12.4.1.2.4
Productos crudos o altamente contaminados.
Pesar porciones de 25 g de producto en dos
vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede
omitirse y el producto puede pesarse directamente en matraces Erlenmeyer
estériles de 500 mL. Adicionar 225 mL de caldo selenito cistina o 225 mL de
caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra analítica. Licuar por
dos min y pasar asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 mL. Dejar reposar y
ajustar el pH como se indica en B.12.4.1.1. Adicionar 2,25 mL de solución de
verde brillante 0,1% y 4,5 mL de solución yodo-yoduro a la muestra que se
enriquecerá con caldo tetrationato. Homogeneizar e incubar. Continuar como se
indica en B.12.4.2.1.
B.12.4.1.2.5
Dulces y dulces cubiertos
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un
vaso para licuadora agregando 225 mL de leche descremada reconstituida. Licuar
por dos min. Manejar igual que en B.12.4.1.1 hasta después de ajustar el pH.
Adicionar 0,45 mL de la solución verde brillante al 0,1% y mezclar bien.
Incubar como se indica en B.12.4.1.1.
B.12.4.2
Aislamiento de Salmonella spp.
B.12.4.2.1
Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de
preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL de la
mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo tetrationato y a otro con 10 mL de
caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.
B.12.4.2.2
Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a
42ºC por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente
enriquecidos en medios selectivos.
B.12.4.2.3
Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa
lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con
cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar
Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo
tetrationato. Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.
B.12.4.2.4
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las
siguientes características:
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden
ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden
aparecer completamente negras.
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden
ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de
la lactosa dan colonias amarillas.
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o
azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden
aparecer completamente negras.
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias
típicas de Salmonella pueden ser
cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio
circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro.
Algunas cepas producen colonias verdes sin
la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o no
se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.
Agar SS: colonias translúcidas,
ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias
fermentadoras de la lactosa son rojas.
B.12.4.3
Identificación Bioquímica
B.12.4.3.1
Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que
se encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e
inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar
hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el
fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC. Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas
con medios selectivos por si es necesario retomar más colonias.
B.12.4.3.2
Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente
positivas para Salmonella las
colonias que den las siguientes reacciones:
B.12.4.3.2.1 Agar
TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la
fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo
más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni
de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo
largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.
B.12.4.3.2.2 Agar
LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la
descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que
produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las
cepas de Salmonella producen ácido
sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.
B.12.4.3.2.3 Retener
todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para
las pruebas adicionales, indicadas en B.12.4.3.3.
B.12.4.3.3 Los
cultivos con TSI que no parecen de Salmonella
spp. pero que presentan reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como
cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá
detectar S. arizonae y cepas atípicas
de Salmonella que utilicen lactosa o
sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en
ambos medios.
B.12.4.3.4 Continuar
el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo
presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las
placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas
bioquímicas nuevamente.
B.12.4.3.5 Continuar
la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados
de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica
seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
B.12.4.3.6 Prueba
de Ureasa
B.12.4.3.6.1
Prueba de Ureasa (convencional). Con un asa estéril, tomar crecimiento del
cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de
caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las
reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.
B.12.4.3.6.2
Prueba de Ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo
urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de agua. Descartar todos los
cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba
negativa (sin cambio de color del medio).
B.12.4.4
Identificación Serológica
B.12.4.4.1 Ensayo
de los Antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero
polivalente O)
B.12.4.4.1.1 Colocar
con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos
o en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las
gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.
B.12.4.4.1.2 Agregar
a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el
canto del asa o empleando aplicadores de madera.
B.12.4.4.1.3 Agitar
inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un
min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.
B.12.4.4.1.4 Considerar
cualquier grado de aglutinación como positiva. La prueba positiva resulta
cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación
en la gota que contiene el cultivo y la solución salina. Si se observa
aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con
las pruebas bioquímicas complementarias.
B.12.4.4.2 Cuando
la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el
subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D
y E, suelen ser los más frecuentes).
B.12.4.4.2.1 Si la
aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar
la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y
repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.
B.12.4.4.2.2 Si no
se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa
al Laboratorio de Enterobacterias del
Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al
Laboratorio Nacional de Salud Pública.
B.12.4.4.3 Si se
requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).
B.12.4.4.3.1 Inocular
el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de
4 a 6 h a 35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día),
o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo
al día siguiente). Adicionar 2,5 mL de solución salina formalizada a 5 mL del
cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).
B.12.4.4.3.2 Colocar
0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para
serología (13 x 100 mm aproximadamente).
Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control de solución
salina mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno
formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observar a
intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es cuando se
observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe
interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre
aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba
inespecífica.
B.12.4.5 Pruebas
Bioquímicas Complementarias
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados
atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a
continuación:
B.12.4.5.1 Inocular
los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la
presencia de la especie S. arizonae.
B.12.4.5.2 Interpretar los
cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:
B.12.4.5.2.1 Agar Citrato de Simmons
Inocular
por estría el tubo. Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
Prueba
positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.
Prueba
negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
B.12.4.5.2.2 Medio SIM
Inocular
por punción. Incubar 24 h a 35 ± 2ºC. Movilidad.
Prueba
positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de
cultivo.
Prueba
negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.
Producción
de ácido sulfihídrico.
Prueba
positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede
extenderse a todo el medio.
Prueba
negativa: ausencia de color negro.
Producción
de indol.
Adicionar
al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de
Kovac.
Prueba
positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.
Prueba
negativa: sin cambio de color.
B.12.4.5.2.3 Caldo RM-VP
Inocular
un tubo con el medio.
Incubar
48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.
B.12.4.5.2.4 Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Transferir
a un tubo un mL del cultivo de 48 h. Adicionar 0,6 mL de solución de alfa
naftol. Adicionar 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%. Adicionar
algunos cristales de creatinina (opcional). Interpretar los resultados después
de incubar 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente.
Prueba
positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.
Prueba
negativa: sin cambio de color.
Reincubar
el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.
B.12.4.5.2.5 Prueba de Rojo de metilo (RM)
Adicionar
al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de
rojo de metilo. Interpretar los resultados inmediatamente.
Prueba
positiva: desarrollo de color rojo.
Prueba
negativa: desarrollo de color amarillo.
B.12.4.5.2.6 Caldo Malonato
Inocular
un tubo conteniendo el medio. Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
Prueba
positiva: desarrollo de color azul.
Prueba
negativa: sin cambio de color.
B.12.4.5.2.7 Caldo Manitol
Inocular
un tubo conteniendo el medio. Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
Prueba
positiva: desarrollo de color amarillo.
Prueba
negativa: sin cambio de color.
B.12.4.5.3 Consultar los resultados
obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las bacterias investigadas.
Nota: los sistemas
bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las
pruebas bioquímicas convencionales.
B.12.4.6 Cálculo y Expresión de Resultados
B.12.4.6.1 Interpretación de
reacciones bioquímicas y serológicas.
CUADRO 1
|
Reacciones bioquímicas |
Reacciones serológicas |
Interpretación |
|
Típica |
Antígeno O Vi o
H positivo |
Cepas
consideradas como Salmonella spp. |
|
Típica |
Todas las
reacciones negativas |
|
|
Típica |
No probada |
Puede ser Salmonella spp. |
|
Reacciones
atípicas |
Antígeno O, Vi o
H positivo |
|
|
Reacciones atípicas |
Todas las
reacciones negativas |
No debe ser
considerada Salmonella spp. |
Nota: Ver imagen 1 al
final del método.
B.12.4.6.2
Reacciones Bioquímicas y Serológicas de Salmonella
spp.
CUADRO 2
|
Prueba o
sustrato |
Positivo |
Negativo |
Reacción |
|
Glucosa (TSI) |
amarillo |
rojo |
+ |
|
Lisina descarboxilasa(LIA) |
púrpura |
amarillo |
+ |
|
H2S (TSI y LIA) |
negro |
no negro |
+ |
|
Ureasa |
rojo-púrpura |
no hay cambio de color |
- |
|
Caldo de lisina descarboxilasa |
púrpura |
amarillo |
+ |
|
Caldo dulcitol rojo de fenol |
amarillo o gas |
no hay cambio de color ni gas |
+ b |
|
Caldo KCN |
crecimiento |
no hay crecimiento |
- |
|
Caldo malonato |
azul |
no hay cambio de color |
- c |
|
Prueba de indol |
superficie color violeta |
superficie color amarillo |
- |
|
Prueba del antígeno flagelar |
aglutinación |
no hay aglutinación |
+ |
|
Prueba del antígeno somático |
aglutinación |
no hay aglutinación |
+ |
|
Caldo lactosa rojo fenol |
amarillo o gas |
no hay cambio de color ni gas |
- c |
|
Caldo sacarosa rojo fenol |
amarillo o gas |
no hay cambio de color ni gas |
- |
|
Prueba Voges- Proskauer |
de rosa a rojo |
no hay cambio de color |
- |
|
Prueba rojo de metilo |
rojo difuso |
amarillo difuso |
+ |
|
Citrato de Simmons |
crecimiento color azul |
no hay crecimiento, no hay cambio de color |
v |
a +, 90%
o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días;v,
variable.
b La
mayoría de los cultivos S. arizonae son
negativos.
c La
mayoría de los cultivos S. arizonae son
positivos.
IMAGEN 1.
Diagrama de Flujo para la determinación de Salmonella
spp.
B.12.4.7
Informe de Resultados
Informar:
Presencia o Ausencia de Salmonella en
__________ g o ____________ mL de muestra.
B.13 Determinación de Listeria monocytogenes.
B.13.1
Fundamento
El método para detectar la presencia de L. monocytogenes se basa en el
aislamiento y la diferenciación de especies de Listeria spp., principalmente por la fermentación de carbohidratos
y la actividad hemolítica de los miembros de este género.
B.13.2
Materiales y Equipo
B.13.2.1
Aceite de inmersión
B.13.2.2
Asas bacteriológicas
B.13.2.3
Cajas Petri
B.13.2.4
Cubreobjetos
B.13.2.5
Matraces Erlenmeyer de 500 mL
B.13.2.6
Lámpara de luz blanca
B.13.2.7
Lápiz graso o marcador
B.13.2.8
Lupa de bajo aumento
B.13.2.9
Pipetas volumétricas de 25, 10 y 1,0 mL
B.13.2.10
Portaobjetos escavado
B.13.2.11
Portaasas
B.13.2.12
Tubos de 16 x 125 mm
B.13.2.13
Tubos de 13 x 100 mm u otros con tapón de rosca
B.13.2.14
Sistema de filtración con membranas con un tamaño de poro de 0,45 µm
B.13.2.15
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
B.13.2.16
Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de
máximas y mínimas.
B.13.2.17
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista
con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura
a 45 ± 0,5°C.
B.13.2.18
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un
homogeneizador peristáltico (Stomacher).
B.13.2.18
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para
homogeneizador peristáltico.
B.13.2.20
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
B.13.2.21
Incubadoras con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC,
provista con termómetro calibrado.
B.13.2.22
Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersión en aceite
(100 X) o microscopio de campo oscuro.
B.13.3
Reactivos
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico.
Cuando se indica agua, debe entenderse que
se trata de agua destilada.
B.13.3.1
Acido acético 5 N
B.13.3.2
Acido clorhídrico 1 M
B.13.3.3
Acido sulfanílico (cristales)
B.13.3.4
Alfa-naftilamina
B.13.3.5
Alfa-naftol 5% en etanol absoluto
B.13.3.6
Etanol absoluto
B.13.3.7
Granalla de zinc
B.13.3.8
Hidróxido de sodio 1 M
B.13.3.9
Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina)
B.13.3.10
Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2
B.13.3.11
Sangre de carnero desfibrinada
B.13.3.12
Solución al 3% de peróxido de hidrógeno
B.13.3.13
Solución salina fisiológica 0,85% estéril
B.13.3.14
Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp
B.13.3.15
Sulfato de cadmio al 20%
B.13.3.16
Zinc pulverizado
B.13.3.17
Reactivos para Tinción de Gram
B.13.3.17.1 Alcohol-acetona
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Etanol (95%) |
700,0 mL |
|
Acetona |
300,0 mL |
Mezclar ambos líquidos.
B.13.3.17.2
Cristal Violeta
Solución A
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Cristal violeta |
2,0 g |
|
Etanol (95%) |
20,0 mL |
Disolver el cristal violeta en el etanol.
Solución B
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Oxalato de amonio |
0,8 g |
|
Agua |
80,0 mL |
Disolver el oxalato de amonio en el agua.
Después de preparar las soluciones A y B,
verter una en la otra y agitar hasta que se mezclen perfectamente.
B.13.3.17.3
Solución de Yodo
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Yodo |
1,0 g |
|
Yoduro de
potasio |
2,0 g |
|
Agua |
300,0 mL |
Triturar finamente el yodo y el yoduro de
potasio en un mortero, de ser posible en una campana de extracción. Añadir una
pequeña cantidad de agua para lavar el material, agregar el resto del agua y
agitar.
Nota: ¡Evitar
el contacto de los reactivos con la piel!
B.13.3.17.4
Solución de Safranina
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Safranina |
0,25 g |
|
Etanol (95%) |
10,00 mL |
|
Agua |
100,00 mL |
Disolver la safranina en el etanol, mezclar,
agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solución con papel filtro.
B.13.3.18
Reactivos para la Determinación de Nitritos
B.13.3.18.1
Reactivo A
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Alfa-naftilamina
|
0,5 g |
|
Acido acético 5N
|
100,0 mL |
B.13.3.18.2
Reactivo B
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Acido
sulfanílico |
1,0 g |
|
Acido acético 5N
|
125,0 mL |
B.13.3.18.3
Reactivo C
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
|
|
|
Acido acético 5N
|
200,0 mL |
B.13.3.18.4
Solución de Sulfato de cadmio al 20%
Colocar granallas de zinc en solución de
sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de cadmio,
adicionando ácido clorhídrico 1N.
B.13.4
Medios de Cultivo
A continuación se presentan las fórmulas y
los procedimientos para preparar los medios empleados en este análisis
microbiológico. En caso de disponer de fórmulas comerciales deshidratadas se
deben seguir las instrucciones del fabricante para su preparación.
B.13.4.1
Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Caldo soya
tripticaseína |
30,0 g |
|
Extracto de
levadura |
6,0 g |
|
Agua |
1000,0 mL |
Agitar hasta disolver los ingredientes.
Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. El pH final de la solución debe ser 7,3
± 0,2.
B.13.4.2
Caldo de Enriquecimiento (EB) pH 7,3
Un litro de caldo soya tripticaseína con
extracto de levadura (CSTEL) debe contener los siguientes suplementos:
|
Suplementos |
Cantidad |
|
Clorhidrato de
acriflavina |
15,0 mg |
|
Acido nalidíxico
(sal sódica) |
40,0 mg |
|
Cicloheximida |
50,0 mg |
|
Acido pirúvico
(sal sódica) solución al 10 %
(p/v) * |
11,1 mL |
* Utilizar solamente cuando se sospeche que
las células de Listeria estén
dañadas. (Ver el punto B.13.6.1)
Preparar los suplementos de acriflavina y
nalidíxico a partir de una solución al 0,5 % (p/v) con agua. El suplemento de
cicloheximida prepararlo como una solución al 1,0 % (p/v) en una solución al 40
% (v/v) de etanol en agua. Esterilizar por filtración los suplementos. Agregar
en condiciones asépticas los suplementos al medio CSTEL previamente
esterilizado, justo antes de su uso. Para la preparación de un litro del medio
CSTEL se debe partir de las soluciones anteriores, agregando las siguientes
cantidades: 3,0 mL de acriflavina, 8,0 mL de ácido nalidíxico y 5,0 mL de
solución de cicloheximida.
Precaución:
¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su
manejo deben emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos
inmediatamente después de usarla!
B.13.4.3
Medio de Cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP)
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Agar fenil
etanol |
35,5 g |
|
Glicina anhídra |
10,0 g |
|
Cloruro de litio |
5,0 g |
|
Solución de
moxolactam al 1 % en amortiguador de fosfatos pH 6,0 |
2,0 mL |
|
Agua |
1000,0 mL |
Esterilizar el medio (sin moxolactam) en
autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. Enfriar de 48 a 50ºC y agregar la
solución de moxolactam previamente esterilizada por filtración. Distribuir
volúmenes de 12 a 15 mL del medio en cajas de Petri estériles. Las placas
delgadas facilitan la observación de las colonias.
B.13.4.4
Medio Oxford
B.13.4.4.1
Medio Base Oxford (OXA)
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Base de agar Columbia |
39,0 g |
|
Esculina |
1,0 g |
|
Citrato férrico amónico |
0,5 g |
|
Cloruro de litio |
15,0 g |
|
Agua |
1000,0 mL |
Agregar los ingredientes a un litro de agua
y llevar a ebullición hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121
± 1ºC durante 15 min. Enfriar a 50ºC el medio base y en condiciones asépticas
agregar los suplementos.
Un litro de medio Oxford debe contener los
siguientes suplementos:
|
Suplementos |
Cantidad |
|
Cicloheximida |
400 mg |
|
Sulfato de colistina |
20 mg |
|
Acriflavina |
5 mg |
|
Cefotetán |
2 mg |
|
Fosfomicina |
10 mg |
Disolver la cicloheximida, el sulfato de
colestina, acriflavina, cefotetán y la fosfomicina en 10 mL de una mezcla 1:1
de etanol: agua. Esterilizar por filtración antes de agregar al medio base.
Mezclar y vaciar en cajas Petri estériles. Las placas del medio Oxford se
pueden almacenar como máximo dos semanas.
B.13.4.5
Agar Soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Agar soya tripticaseína |
40,0 g |
|
Extracto de levadura |
6,0 g |
|
Agua |
1000,0 mL |
Agitar y calentar a ebullición hasta
disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.
B.13.4.6
Agar Sangre de carnero
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Base de agar sangre |
95,0 mL |
|
Sangre de carnero desfibrinada |
5,0 mL |
Preparar el agar base de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar asépticamente la
sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente
(20 - 25°C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12
a 15 mL para la prueba de CAMP y de 15 a 20 mL para la prueba de hemólisis.
B.13.4.7
Caldo Nitratos
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Nitrato de potasio |
1,0 g |
|
Cloruro de sodio |
0,5 g |
|
Peptona |
2,0 g |
|
Agua |
1000,0 mL |
Agregar los ingredientes a un litro de agua,
agitar hasta disolución completa. Verter en tubos de 13 x 100 mm con tapón de
rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min.
B.13.4.8
Medios para la Prueba de Movilidad
B.13.4.8.1
Medio de SIM
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Peptona de caseína |
20,0 g |
|
Peptona de carne |
6,1 g |
|
Sulfato de fierro y amonio |
0,2 g |
|
Tiosulfato de sodio |
0,2 g |
|
Agar |
3,5 g |
|
Agua |
1000,0 mL |
Agitar y calentar a ebullición hasta
disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm.
Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.
B.13.4.8.2
Medio MTM
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Extracto de carne |
3,0 g |
|
Peptona |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio (NaCl) |
5,0 g |
|
Agar |
4,0 g |
|
Agua |
1000,0 mL |
Agitar y calentar a ebullición hasta
disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm.
Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,4 ± 0,2.
B.13.4.9
Caldo Púrpura para fermentación de carbohidratos
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Proteosa peptona No. 3 |
10,00 g |
|
Cloruro de sodio |
5,00 g |
|
Extracto de carne |
1,00 g |
|
Púrpura de bromocresol |
0,02 g |
|
Agua |
1000,00 mL |
Calentar si es necesario para disolver los
ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 min. A 121 ± 1°C pH final 6,8
± 0,2. Agregar la solución del carbohidrato, previamente esterilizada, por
filtración en cantidad suficiente para obtener una concentración final de 0,5
%.
Nota: Los
sistemas bioquímicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para
las pruebas bioquímicas convencionales.
B.13.5
Preparación de la Muestra
Para la preparación de la muestra seguir con
lo establecido en el numeral 9 de este apéndice.
B.13.6
Procedimiento
Este método debe realizarlo un microbiólogo
experimentado, en un ambiente controlado, aislado de áreas de producción de
alimentos. Se debe tener especial cuidado en la disposición de aquellos
materiales y equipo que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos,
antes de desecharlos o volver a utilizarlos. Esta técnica por ningún motivo
debe aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso
de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada.
B.13.6.1
Procedimiento de Enriquecimiento
Tomar una muestra representativa del
alimento, tanto de la superficie externa como del interior Colocar 25 mL o 25 g
de la muestra en un recipiente conteniendo 225 mL de medio de enriquecimiento
(EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30ºC. En el caso de muestras en donde
se sospecha que tienen células de Listeria
spp dañadas, se recomienda la incubación en un caldo de enriquecimiento que
contenga piruvato de sodio al 0,1 %
(p/v) incubado a 30°C por 6 h sin suplementos. Después de las 6 h de incubación
los suplementos deben agregarse y continuar la incubación a 30ºC hasta un total
de 48 h.
B.13.6.1.1
Aislamiento
Después de 24 y 48 h de incubación en el
medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las placas del medio LMP a
30ºC por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35ºC por el mismo periodo. Observar el
crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un ángulo de 45º
(iluminación de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este
medio generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes.
En el medio OXA las colonias de Listeria son
negras, con halo negro. Algunas colonias pueden aparecer con un tono café
oscuro que se define mejor a los siete días de incubación. Seleccionar cinco o
más colonias típicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL.
Este paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los
medios OXA y LMP pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente
inhibida, invisible a simple vista. Debido a que puede estar presente más de
una especie de Listeria en la
muestra, deben identificarse como mínimo cinco colonias.
B.13.6.2
Identificación
Se deben utilizar cepas de referencia
positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar colonias
típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35ºC por 24 h. Estos cultivos pueden
mantenerse a 4ºC y utilizarse como inóculo para realizar las pruebas de
identificación.
B.13.6.2.1
Prueba de Movilidad en Fresco
Hacer preparaciones en fresco (en gota
suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solución salina al 0,85%.
La suspensión debe ser densa y emulsificarse completamente, y observar con
objetivo de inmersión en un microscopio de contraste de fase o microscopio de
campo oscuro. Las células de Listeria spp
son bacilos cortos con movilidad
rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rápidos no son Listeria spp.
B.13.6.2.2 Prueba de Catalasa
Emulsificar
un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%. La formación
inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positivo.
Precauciones, la emulsión debe realizarse con un asa de plástico o palillo de
madera estéril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias
provienen de agar base con sangre. Cualquier contaminación de eritrocitos puede
dar pruebas falsas positivas!
B.13.6.2.3 Tinción de Gram
Hacer
una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos
Grampositivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse como formas
cocoides. ¡En extensiones delgadas se observan de color pálido y pueden
confundirse con Bacteroides spp.
B.13.6.2.4 Prueba de Hemólisis
Dibujar
una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de
carnero al 5%. Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48
h a 35ºC. Al inocular, observar la reacción hemolítica en las placas. L. monocytogenes
y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto
de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP.
B.13.6.2.5 Prueba de Reducción de Nitratos
Inocular
los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC por 5 días. Para la
lectura se debe agregar 0,2 mL del reactivo A y 0,2 mL del reactivo B, un color
rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no
se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de una
hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). En forma alternativa
adicionar al cultivo en caldo nitratos 0,2 mL del reactivo B y 0,2 mL del
reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de
nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar 0,2 mL del reactivo de
cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa
(presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa
- naftilamina, que es carcinogénica.
B.13.6.2.6 Prueba de Movilidad en Agar
Inocular
el medio SIM o MTM, incubar por 7 días a temperatura ambiente (20-25ºC),
observar diariamente. Las especies de Listeria
son móviles, dando un crecimiento típico en forma de paraguas.
B.13.6.2.7 Prueba de Utilización de
Carbohidratos
Inocular
tubos de caldo púrpura para fermentación de carbohidratos al 0,5 %: dextrosa,
esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. Una
coloración amarilla indica una prueba positiva. Todas las especies de Listeria dan positivas las pruebas para
dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 para reacciones con
ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentación prematura del aislamiento en el
medio OXA no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede omitirse.
B.13.6.2.8 Prueba de Cristie-Atkins
-Munch-Peterson (CAMP)
Para la
prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de colección de S. aureus
y R. equi:
|
Staphylococcus aureus |
Rhodococcus equi |
|
ATCC 49444 |
ATCC 6339 |
|
NCTC 7428 |
NCTC 1621 |
|
ATCC 25923 |
|
|
CIP 5710 |
|
Las
cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones
nacionales e internacionales. En una placa de agar sangre de carnero sembrar
una estría de la cepa de S. aureus y, paralelamente una de R. equi,
separadas lo suficiente para que entre éstas se puedan estriar
perpendicularmente las cepas sospechosas de Listeria,
sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separación). Después de 24 y
48 h de incubación a 35°C observar el sinergismo entre las hemolisinas de S. aureus,
R. equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemolítica más intensa.
La
hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa cerca de la
estría de S. aureus, y la hemólisis de L.
ivanovii se aumenta cerca de la
estría de R. equi. Las especies restantes no son hemolíticas en esta prueba.
Prueba
de CAMP para Listeria monocytogenes:
Diseño de la inoculación en placas de agar
sangre de carnero. Las líneas horizontales representan las estrías de la
inoculación de cinco cepas. Las líneas verticales representan las estrías de
inoculación de S. aureus (S) y R. equi (R). Las líneas
sombreadas indican el incremento de hemólisis en esas regiones.
Cuadro 1.
Diferenciación de las Especies de Listeria
|
Especies |
Hemolítico
(beta) a |
Reducción
nitratos |
Producción de
ácidos de |
CAMP |
|||
|
M |
R |
X |
S.a |
R.e |
|||
|
L. monocytogenes |
+ |
- |
- |
+ |
- |
+ |
- |
|
L. ivanovii |
+ |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
|
L. innocua |
- |
- |
- |
bV |
- |
- |
- |
|
L. welshimeri |
- |
- |
- |
bV |
+ |
- |
- |
|
L. seeligeri |
+ |
- |
- |
- |
+ |
+1 |
- |
|
L. grayic |
- |
bV |
+ |
bV |
- |
- |
- |
a Sangre
de carnero desfibrinada
bV Variable
L. grayi incluye
ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa
variable
M Manitol
R Ramnosa
X Xilosa
S.a Staphylococcus
aureus
R.e Rhodococcus
equi
1 Puede
haber reacciones débilmente positivas, particularmente a las 48 horas de
incubación.
B.13.6.3
Serología
La determinación de los tipos serológicos de
Listeria se aplica cuando las
consideraciones epidemiológicas sean cruciales. Inocular en caldo de triptosa
por 24 h a 35ºC. Transferir a dos tubos de agar inclinado de triptosa e incubar
24 h a 35ºC. Para realizar la prueba se pueden utilizar sueros comerciales,
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Cuadro 2.
Serología de las especies de Listeria
|
Especies |
Serotipo |
|
L. monocytogenes |
1/2A, 1/2B, 1/2C 3A, 3B, 3C 4A, 4AB, 4B 4C, 4D, 4E, "7" |
|
L. ivanovii |
5 |
|
L. innocua L .welshimeri |
4AB, 6A, 6B, Una 6A, 6B |
|
L.seeligeri |
1/2B, 4C, 4D, 6B, Una |
B.13.7
Expresión de Resultados
Comparar los resultados obtenidos con el
cuadro 1 y determinar el género y especie de las cepas aisladas. La
correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del
género Listeria.
El único miembro del género Listeria de importancia para esta norma
es Listeria monocytogenes.
B.13.8
Informe de la Prueba
Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes
informar la presencia en 25 g o 25 mL de muestra. Y si los resultados son
negativos informar ausencia en 25 g o 25 mL de muestra.
B.14
Determinación de Vibrio cholerae
B.14.1
Material y Equipo
B.14.1.1
Licuadora y vasos de licuadora estériles.
B.14.1.2
Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 mL de capacidad con
tapa de rosca.
B.14.1.3
Varilla de vidrio de 3mm de diámetro y 20cm de largo, con un doblez
terminal en ángulo recto de 4cm.
B.14.1.4
Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad.
B.14.1.5
Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad.
B.14.1.6
Incubadoras de 39-40ºC.
B.14.1.7
Baño de agua de 42 ± 0,2ºC y 35-37ºC.
B.14.1.8
Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir
muestras de alimentos.
B.14.1.9
Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico.
B.14.1.10 Pipetas estériles
de 1 mL con graduación de 0,01mL, de 5 y 10 mL con graduación de 0,1mL.
B.14.1.11 Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino.
B.14.1.12 Tubos de cultivo o
de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm.
B.14.1.13 Tubos para
bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm.
B.14.1.14 Tijeras y pinzas
estériles.
B.14.115 Lámpara (para
observar reacciones serológicas).
B.14.1.16 Mecheros.
B.14.1.17 Papel pH (rango
1-14) con un máximo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio de color.
B.14.1.18 Potenciómetro.
B.14.1.19 Bolsas de polietileno
de 28 x 37 cm con tapa resellable.
B.14.1.20
Aparato de filtración y membranas de 0,45 micras.
B.14.2
Medios de Cultivo
B.14.2.1
Agua Peptonada Alcalina (APW)
FORMULA
|
Peptona |
10 g |
|
Cloruro de sodio |
10 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Disolver
los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste
sea de 8,5±0,2.Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121ºC.
B.14.2.2
Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS)
FORMULA
|
Extracto de levadura |
5g |
|
Proteosa peptona |
10 g |
|
Sacarosa |
20 g |
|
Tiosulfato de sodio.5H2O |
10 g |
|
Citrato de sodio.2H2O |
10 g |
|
Sales biliares |
3 g |
|
Bilis de buey |
5 g |
|
Cloruro de sodio |
10 g |
|
Citrato férrico |
1 g |
|
Azul de bromotimol |
40 mg |
|
Azul de timol |
40 mg |
|
Agar |
15 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Preparar
en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de
medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con
agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No
esterilizar. Enfriar a 50ºC y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas
de 37-45ºC antes de usar.
B.14.2.3
Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)
Solución
1:
FORMULA
|
Peptona |
10 g |
|
Extracto de
carne |
5 g |
|
Cloruro de sodio |
20 g |
|
Solución Stock
de colorante1 000 |
1 mL |
|
Agar |
15 g |
|
Agua destilada |
900 mL |
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se
disuelva el agar. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121ºC. Enfríe de
48-55ºC.
Solución
stock de colorantes 1 000 X:
FORMULA
|
Azul de
bromotimol |
4 g |
|
Rojo de cresol |
4 g |
|
Etanol al 95% |
100 mL |
Para obtener un color firme del medio usar
una solución colorante stock en lugar de estar pesando repetidamente los
colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al
4% (peso/volumen). Agregue 1 mL de esta solución a cada litro de agar mCPC, la
cual tendrá al final 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo cresol por
litro.
Solución
2:
FORMULA
|
Celobiosa |
10 g |
|
Colistina |
400 000 UI |
|
Polimixina B |
100 000 UI |
|
Agua destilada |
100 mL |
Disuelva la celobiosa por calentamiento en
agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por filtración,
agregue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.
B.14.2.4
Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal)
FORMULA
|
Triptona o tripticasa |
10 g |
|
Cloruro de sodio |
10 g |
|
Agar |
20 g |
|
Agua destilada mL |
1 000 |
Suspenda los ingredientes y hierva hasta
disolución del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. Esterilice en
autoclave 15 minutos a 121ºC. Deje solidificar los tubos inclinados, para
placas enfríe el medio de 45-50ºC y distribuya en cajas Petri estériles.
B.14.2.5
Agar Gelatina (GA)
FORMULA
|
Peptona |
4 g |
|
Extracto de levadura |
1 g |
|
Gelatina |
15 g |
|
Agar |
15 g |
|
Agua destilada |
1000 mL |
Suspenda los ingredientes y hierva hasta
disolución de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 ± 0.2. Esterilice en
autoclave 15 minutos a 121ºC. Enfríe de 45-50ºC y distribuya en cajas Petri
estériles.
B.14.2.6
Agar Gelatina con Sal (GS)
Preparar agar gelatina (GA), pero
adicionando 30 g de cloruro de sodio por cada litro. Suspenda los ingredientes
y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 ± 0,2.
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC. Enfríe de 45-50ºC, coloque en cajas
Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp tal como V.
alginolyticus, use de 25-30 g de agar por litro.
B.14.2.7
Caldo Glucosa de Hugh-Leifson
FORMULA
|
Peptona |
2 g |
|
Extracto de levadura |
0,5 g |
|
Cloruro de sodio |
20 g |
|
Dextrosa |
10 g |
|
Púrpura de bromocresol |
0,015 g |
|
Agar |
3 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Suspenda los ingredientes y hierva hasta
disolver el agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y esterilice en
autoclave 15 minutos a 121ºC.
B.14.2.8 Medio Base de Descarboxilasa
(Arginina, Lisina y Ornitina)
FORMULA
BASE
|
Peptona |
5 g |
|
Extracto
de levadura |
3 g |
|
Dextrosa
(D-glucosa) |
1 g |
|
Púrpura
de bromocresol |
0.02 g |
|
Agua
destilada |
1 000 mL |
Para
caldo de arginina, lisina y ornitina, adicione 5 g de L-aminoácido a 1 litro de
base. Como control, use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio spp
halofílicos, adicionar 15 g de cloruro de sodio por litro. Ajuste el pH de tal
manera que después de la esterilización sea de 6,5 ± 0,2. Distribuya en tubos y
esterilice en autoclave 10 minutos a 121ºC.
B.14.2.9 Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3,
T1N6,T1N8 y T1N10
FORMULA
|
Triptona o
tripticasa |
10 g |
|
Cloruro de sodio |
0,10,30,60,80 o
100 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Disuelva
los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue cloruro de sodio, para
T1N1 use 10g de cloruro de sodio (1% w/v concentración de cloruro de sodio);
así respectivamente. Para T1N3 usar 30g de NaCl por litro (3% w/v concentración
de cloruro de sodio). Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 mm,
tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Ajuste el
pH a 7,2 ± 0,2.
B.14.2.10 Caldo Soya Tripticasa (TSB)
FORMULA
|
Peptona de
tripticasa (Triptona) |
17 g |
|
Peptona de
fitona (Soytona) |
3 g |
|
Cloruro de sodio |
5 g |
|
Fosfato
dipotásico |
2,5 g |
|
Dextrosa |
2,5 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Suspenda
los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225
mLen matraces de 500 mL o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a
121ºC. El pH final debe ser de 7,2 ± 0,2.
B.14.2.11 Agar Soya Tripticasa (TSA)
FORMULA
|
Peptona tripticasa
(Triptona) |
15 g |
|
Peptona de
fitona (Soytona) |
5 g |
|
Cloruro de sodio |
5 g |
|
Agar |
15 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Suspenda
los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolución
del agar. Para Vibrio spp halofílicos, agregar 15 g de cloruro de sodio.
Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en autoclave durante 15
minutos a 121ºC. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de
45-50ºC y distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2.
B.14.2.12 Agar de Hierro Kligler (KIA)
FORMULA
|
Peptona
polipeptona |
20 g |
|
Lactosa |
20 g |
|
Dextrosa |
1 g |
|
Cloruro de sodio |
5 g |
|
Citrato férrico
amoniacal |
0,5 g |
|
Tiosulfato de
sodio |
0,5 g |
|
Rojo de fenol |
0,025 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Suspender
los ingredientes y hervir hasta disolución del agar. Distribuir en tubos de
tapón de rosca. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Dejar
solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7,4 ± 0,2.
B.14.2.13 Agar Arginina Glucosa Inclinado
(AGS)
FORMULA
|
Peptona |
5 g |
|
Extracto de
levadura |
3 g |
|
Triptona |
10 g |
|
Cloruro de sodio |
20 g |
|
Glucosa |
1 g |
|
L-Arginina(hidrocloruro) |
5 g |
|
Citrato férrico
amónico |
0,5 g |
|
Tiosulfato de
sodio |
0,3 g |
|
Púrpura de
bromocresol |
0,2 g |
|
Agar |
13,5 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Suspender
los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolución del agar, y
distribuir en cantidades de 5 mL a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6,8 a
7,0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a 121ºC. Deje solidificar el
medio inclinado.
B.14.2.14 Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI)
FORMULA
|
Polipeptona |
20 g |
|
Cloruro de sodio |
5 g |
|
Lactosa |
10 g |
|
Sacarosa |
10 g |
|
Glucosa |
1 g |
|
Sulfato ferroso
amónico |
0,2 g |
|
Tiosulfato de
sodio |
0,2 g |
|
Rojo de fenol |
0,025 g |
|
Agar |
13 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Disolver
los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición,
agitando ocasionalmente hasta completa disolución. Enfriar a 60ºC y ajuste el
pH de 7,3 ± 0,1.
B.14.2.15
Agar de Hierro y Lisina (LIA)
FORMULA
|
Peptona o
gelisato |
5,0 g |
|
Extracto de
levadura |
3,0 g |
|
Glucosa |
1,0 g |
|
L-Lisina |
10,0 g |
|
Citrato férrico
amónico |
0,5 g |
|
Tiosulfato de
sodio |
0,04 g |
|
Púrpura de
bromocresol |
0,02 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Disolver los ingredientes en el agua
destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación frecuente
hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a
121ºC. Enfriar de 50-60ºC y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en volúmenes
de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en posición inclinada, de
tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2
cm.
B.14.2.16
Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP)
FORMULA
|
Peptona |
7 g |
|
Glucosa |
5 g |
|
Fosfato dipotásico |
5 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Disolver los ingredientes en 800 mL de agua
tibia. Para Vibrio spp halofílicos,
agregar 15 g más de cloruro de sodio (para una concentración final del 2%).
Filtrar, enfriar a 20ºC y diluir a 1 litro. Distribuya en tubos. Esterilizar en
autoclaves durante 12 - 15 minutos a 121ºC. Ajustar el pH de 6,9 +/- 0,2.
B.14.2.17
Medio para Prueba de Movilidad (semisólida)
FORMULA
|
Peptona |
10 g |
|
Extracto de carne |
3 g |
|
Cloruro de sodio |
5 g |
|
Agar |
4 g |
|
Agua destilada |
1 000 mL |
Calentar con agitación y hervir de 1 a 2
minutos hasta disolución del agar. Para Vibrio spp halofílicos agregar 15 g más
de cloruro de sodio (para una concentración final del 2%). Distribuir en tubos
con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Ajustar el pH
de 7,4 ± 0,2.
B.14.3
Soluciones y Reactivos
B.14.3.1
Prueba de rojo de metilo.
Reactivo
FORMULA
|
Rojo de metilo |
0,1 g |
|
Alcohol etílico |
300 mL |
|
Agua destilada |
200 mL |
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y
diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la
solución a 5 mL del cultivo problema. Resultados: Un color rojo demuestra un pH
menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta como prueba
Negativa.
B.14.3.2
Prueba de Vogues-Proskauer.
Esta prueba es para comprobar la presencia
del diacetilo.
Reactivo
FORMULA
|
Alfa naftol |
5 g |
|
Alcohol etílico absoluto |
100 mL |
Añadir 0,6 mL de la solución de alfa naftol
y 0,2 mL de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 mL de cultivo. Resultados: El
desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción
Positiva.
B.14.3.3 Prueba de oxidasa.
Reactivo
FORMULA
|
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino |
0,5 g |
|
Agua destilada |
100 mL |
Conservar
en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. Sembrar en
un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35ºC. Agregar 0,3 mL
de reactivo. Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un
color azul en un minuto.
B.14.3.4 Reacción de indol.
Reactivo de Kovac
FORMULA
|
P-dimetilaminobenzaldehído |
5.0 g |
|
Alcohol amílico
o alcohol isoamílico |
750 mL |
|
Acido
clorhídrico concentrado |
25 mL |
Disolver
el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido
clorhídrico lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco
ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va del amarillo al café
claro. Se debe conservar a 4ºC.
B.14.4 Procedimiento
Sembrar
un tubo con 5 mL de caldo triptona. Incubar 48 horas a 35ºC. Agregar de 0,2 a
0,3 mL del reactivo. El desarrollo de un color intenso constituye una prueba
Positiva para indol. Toma de muestra La toma de muestra para análisis
microbiológicos se deberá hacer en condiciones asépticas y en recipientes
estériles.
B.14.4.1 Preparación de la Muestra
Para la
preparación de la muestra seguir con lo establecido en el numeral 9 de este
apéndice.
Para
helados o bases o mezclas para helados y para los quesos, se deben preparar las
siguientes diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6. Tomar 25 gramos de helado o bases o
mezclas para helados o queso previamente molido e introducirlos en un vaso
estéril de licuadora de 500 mL de capacidad que contenga 225 mL de agua
peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 minutos a la máxima velocidad.
Esta es la dilución 1:10. De ésta preparar la dilución, 1:100, 1:1000, 1:10000,
1:100000 y 1:1000000, en 9 o 90 mL de agua peptonada alcalina. Incubar las seis
diluciones entre 35ºC - 37ºC.
B.14.4.2 Resembrar
Después
de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la película
(crecimiento superficial) con un asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo
menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar con tiosulfato,
citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa,
polimixina B y colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clásico de V.
cholerae. Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 horas de 35-37ºC y el agar mCPC
durante 18 a 24 horas de 39-40ºC.
B.14.5 Morfología Colonial.
Examinar
las placas a fin de determinar si se presentan las características coloniales
que a continuación se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias
sospechosas de cada placa y aplicarlas con estría cruzada para aislar en agar
T1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e
incubar durante 12-18 horas a 35-37°C. Es necesario hacer un cultivo en un
medio no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias, antes de las
pruebas bioquímicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina
sal (GS) en el segundo día. Los resultados serán confiables si las placas de
aislamiento muestran colonias puras.
a.- Agar TCBS.
Las
colonias de V. cholerae (El Tor y
Clásico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la fermentación de la
sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes
translúcidos.
Nota: Las especies de
vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS. Las colonias
de V. mimicus, que están
estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa
negativas). La mayoría de las demás especies de vibrio crecen en agar TCBS y
producen colonias amarillas y verdes.
b.- Agar mCPC.
Las
colonias de V. cholerae El Tor son
púrpuras (negativas para la fermentación de la celobiosa). El V. vulnificus produce colonias amarillas
achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos. La mayoría de las
demás especies de Vibrio spp. no
crecen fácilmente en agar mCPC.
B.14.6 Diferenciación.
Diferenciación
de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios.
a.- TSI,KIA y agar
inclinado de Arginina y Glucosa (AGS).
Inocular
las colonias individuales en medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y
Hierro), KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar
inclinado. Incubar los tubos inoculados, con el tapón no muy apretado, durante
18 a 24 horas de 35-37ºC. Se recomiendan estos medios porque las reacciones
permiten efectuar una diferenciación presuntiva entre la mayoría de las
especies de vibrio, Aeromonas, Plesiomonas shigella y otras bacterias.
b.- Caldo triptona al
3% de NaCl (T1N3).
Inocular
las colonias en los caldos T1N0 y T1N3 e incubar durante 18 a 24 horas de
35-37ºC. El V. cholerae y el V. mimicus crecerán en T1N0 y T1N3.
Algunas especies de bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones
similares a las de V. cholerae en
medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayoría de las especies de Vibrio spp, incluyen algunos V. cholerae No. 01, crecerán en T1N3
únicamente de la familia Vibrionaceae
crece solamente en T1N3. Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA) y
agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para determinar la tolerancia de los cultivos
puros a la sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular una línea recta
en el centro de un sector de las placas, tanto de GA como de GS con cada
cultivo puro. Incubar durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. V. cholerae y el V. mimicus
crecerán. El Vibrio spp haloflico
crecerá en ambas placas, porque ellos no requieren de sal. Sólo en la placa con
GS. Para leer la reacción de la gelatinasa sostener la placa sobre una
superficie negra, observará un halo opaco alrededor de la colonia de los
microorganismos gelatinasa positivos.
c.- Caldo glucosa de Hugh-Leifson.
Inocular
colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson.
Recubrir un tubo con una capa de aceite mineral estéril o vapor líquido (50% de
petrolato y 50% de parafina) unos dos centímetros de grueso. Incubar ambos
tubos durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la
fermentación. Las especies de pseudomonas, que comúnmente se aíslan del pescado
y los mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de
vibrio, utilizan la glucosa sólo para la oxidación.
d.- Prueba de
Oxidasa.
Realizar
la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u
otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste
en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con
algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un
mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa
y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel
se tornará púrpura oscura o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio spp. son oxidasa positivas
(excepto el V. metschnnikovii).
B.14.7 Identificación y Confirmación de V.chloreae 01, V.cholerae NO 01 y V. mimicus.
a.- Leer los resultados de las prueba
bioquímicas de TSI, KIA, AGS, T1N0 y T1N3 o GA y GS, y caldo glucosa de
Hugh-Leifson.
b.- Hacer una tinción de Gram a un cultivo
de 18 a 24 horas en caldo o agar.
Nota: Los cultivos puros
que se someterán a las demás pruebas serológicas y bioquímicas para el V. cholerae son sacarosa positivos
(amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V. mimicus o son celobiosa negativos
(verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo T1N0 o en placas con GA;
presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa
positivos, son bacilos curvos gram negativos y producen ácido a partir de la
glucosa, tanto en la oxidación como en la fermentación, en el caldo de cultivo
de Hugh-Leifson.
c.- Pruebas Bioquímicas.
Las
reacciones bioquímicas para identificación de V. cholerae y otras especies bacterianas afines figuran en el
cuadro anexo. La fórmula para todos los medios bioquímicos deberá contener por
lo menos un 2% de NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras
AP120E, con 2% de NaCl como diluyente. Para el V. cholerae se puede usar solución salina fisiológica (0,85% de
NaCl) como diluyente.
d.- Prueba Serológica de Aglutinación.
Usar
antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo Inaba (factores AC) y
Ogawa (Factores AB) para el antígeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24
horas producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y negativos, y los
controles salinos para cada antisuero usado. Seguir las instrucciones del
antisuero.
Como es
posible que los antígenos de los antisueros estén relacionados entre sí, hay
que realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae 01 o No. 01.
Nota: Anticuerpos
monoclonales están disponibles, pero el anti-B y anti-C reaccionan opuestamente
con bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o
monoclonales será para el antígeno del complejo 01
1.- Los
cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01, pero no en solución
salina fisiológica simple, son de V.
cholerae del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirman que el
cultivo puro es de V. cholerae. Los
cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos específicos pueden ser
clasificados según el subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa.
- Los cultivos que aglutinan con el suero
polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa, tienen los 3
factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.
- Los cultivos que aglutinan con el
antisuero polivalente, pero no aglutinan con antisueros Inaba y Ogawa, no se
pueden tipificar con estos antisueros.
2.- Los
cultivos de V. cholerae cuya
identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y que no aglutinen con el
antisuero del grupo 01 son V. cholerae
0:1. El suero para la clasificación de V.
cholerae No 0:1 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebeling.
3.- Los
cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solución salina, no
se pueden clasificar según el tipo. Sin embargo, si se usa un medio más rico,
como en TSA o agar infusión cerebro corazón (BHI), se puede eliminar esta
autoaglutinación.
e. Características mínimas para la
identificación de V. cholerae.
Las características que permiten suponer la
presencia de V. cholerae como mínimo
son las siguientes:
1.- Morfología.
Bacilo o bacilo encorvado, no esporogénico y
gram negativo.
2.- Aspecto
en TSI.
Estría ácido, picadura ácido, gas negativo y
H2S
negativo.
3.- Prueba
de Hugh-Leifson.
Fermentación de la glucosa y oxidación
positiva.
4.- Citocromo-oxidasa
positivo.
5.- Prueba
de la dihidrolasa arginina: negativo.
6.- Prueba
de la lisinadescarboxilasa: positivo.
7.- Prueba
de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V.
mimicus.
8.- Crecimiento
a 42ºC: positivo.
9.- Prueba
de halofilia con NaCl.
0%: positivo, 3%: positivo, 6%: usualmente
negativo. Algunas cepas de V. cholerae
NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl.
10.- Fermentación
de la sacarosa: positivo para V. cholerae
(negativo para V. mimicus).
11.- Prueba
de ONPG: positivo.
12.- Fermentación
de la arabinosa: negativo.
13.- 0/129
sensitiva: sensible para 10 y 150 µg 0/129
B.14.8
Reacciones
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio spp. EN AGAR KIA, TSI Y AGS.
|
Microorganismos |
KIA |
TSI |
AGS |
|||
|
Estría |
Picadura |
Estría |
Picadura |
Estría |
Picadura |
|
|
V.cholerae |
K |
A |
A(K)* |
A |
K |
a |
|
V.mimicus |
K |
A |
K(A)* |
A |
K |
A |
|
V.parahaemolyticus |
K |
A |
K |
A |
K |
A |
|
V.alginolyticus |
K |
A |
A |
A |
K |
A |
|
V.vulnificus |
K o A |
A |
K(A)* |
A |
K |
A |
|
Aeromonas .hidrophyla |
K o A |
A |
K o A |
A |
K |
K |
|
Plesiomonas shigelloides |
K o A |
A |
K o A |
A |
N |
N |
* = Raramente
K = Alcalino
A = Acido
a = Ligeramente ácido
N = Neutro
Ninguna de las especies enumeradas produce
sulfuro de hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, ni una cantidad perceptible de
gas a partir de glucosa en medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de Aeromonas spp. Pueden producir gas a
partir de glucosa en estos medios.
B.15
Determinación de Enterotoxina Estafilocóccica, por el método de Elisa.
B.15.1
Principio del Método.
Este método se basa en un inmunoensayo
visual el cual proporciona una prueba rápida (4 h), sensible (1,0 ng o más por
mL o g), y específica para la identificación de las enterotoxinas A-E
estafilocóccicas. Sin embargo, con esta prueba no se identifican los serotipos
de enterotoxina, en forma individual. La prueba de Elisa se realiza en
configuración de "sandwich".
B.15.2
Materiales y Equipo
B.15.2.1
Algodón absorbente.
B.15.2.2
Micropipetas de 50-200 mL y
5-20 mL.
B.15.2.3
Puntas de plástico para micropipeta.
B.15.2.4
Plástico para envolver o sellar recipientes de plástico.
B.15.2.5
Papel pH (intervalo 0-14).
B.15.2.6
Frascos de plástico de 500 mL.
B.15.2.7
Jeringas de plástico de 25 mL.
B.15.2.8
Tubos para centrífuga.
B.15.2.9
Tubos de polipropileno de 12 x 75 mm.
B.15.2.10
Polietilen glicol (PEG, peso molecular de 15,000-20,000).
B.15.2.11
Tubo de diálisis (12,000-14,000 peso molecular exclusión).
B.15.2.12
Vasos de precipitados de 250 mL.
B.15.2.13
Filtros tipo jeringa (para
filtrar los alimentos). Preparar jeringas de plástico desechables (0,25 mL) e
insertar suficiente cantidad de algodón absorbente, para hacer un empaque de
0,5 cm. Pasar 5,0 mL de agua destilada, presionar con el émbolo para asegurarse
de formar un paquete firme. Preparar inmediatamente antes de filtrar los
extractos de alimento, para tratar con el aditivo provisto con el equipo.
B.15.2.14
Placa de 48 o 96 pozos recubiertos con el grupo de antisueros *.
B.15.2.15
Soporte para sostener la placa *.
B.15.2.16
Instructivo del método *.
B.15.2.17
Comparador de color *.
B.15.2.18
Hoja de resultados *.
B.15.2.19
Materiales suministrados por el fabricante.
B.15.2.20
Equipo TECRATM.
B.15.2.21
Incubadora a 35-37°C.
B.15.2.22
Omnimixer, licuadora (o equivalente) para la preparación de los
extractos de alimentos.
B.15.2.23
Centrífuga a 1000 -3000 x g.
B.15.2.24
Agitador de microplacas (opcional).
B.15.2.25
Lector de microplacas (opcional).
B.15.2.26
Balanza.
B.15.3
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación
y por agua debe entenderse agua destilada.
B.15.3.1
Solución amortiguadora Tris 0,25 M (30,28 g TRIS/L, pH 8,0).
B.15.3.2
Solución de hidróxido de sodio 1,0 N (NaOH).
B.15.3.3 Acido
clorhídrico (HCl).
B.15.3.4 Agua
destilada o deionizada.
B.15.3.5
Hipoclorito de sodio.
B.15.3.6 BHI
con 0,7% de agar (m/v).
B.15.3.7
Solución de lavado. Contiene: 1,5 g de tris(hidroximetil) aminometano (Tris),
6g de NaCl, 2,0 g polioxietilen sorbitan monolaurato (Tween 20), y 0,001 g de
timerosal en 25,0 mL de H2O *
B.15.3.8
Aditivo para la muestra. Es una solución que contiene: 2 g de Tween 20 y 0,001
g de timerosal en 6,0 mL de H2O *.
B.15.3.9
Control positivo: Diluir 25 mL de
control positivo concentrado (toxina estafilocóccica tipo B, 0,1 g Na2B4O7, 0,1 g de NaCl y
0,001 g de timerosal en 4,0 mL de H2O), en 2,5 de sol. de lavado (B.15.4.2.1) *.
B.15.3.10
Control negativo. Contiene: 0,0072 g de Tris, 0,1 g de NaCl, 0,001 g de
timerosal y 0,01 g de Tween 20 en 6,0 mL de H2O *.
B.15.3.11
Diluyente del Conjugado. Contiene: 0,2 g Na2B4O7, 0,1 g
de NaCl, 0,1 g de gelatina, y 0,001 g de timerosal en 13,5 mL de H2O *.
B.15.3.12
Conjugado liofilizado. Un frasco que contiene antisuero polivalente (A-E)
liofilizado, conjugado; 0,003g de Na2B4O7, 0,002 g de CaCl2, y 0,0001 g de
timerosal. Para su uso, agregar al frasco 13 mL del diluyente (B.15.3.11) *.
B.15.3.13
Diluyente del Substrato. Cada 26 mL de H2O contienen 0,2 g de ácido acético y 0,01 g de
H2O2*.
B.15.3.14
Substrato. Un frasco de liofilizado
que contiene; 0,01 g de 2,2´-di-azino(sulfonato de 3-etil benzotiazolin), 0,01
g de EDTA, y 0,1 g de NaH2PO4. Para
su uso, agregar al frasco 26 mL del diluyente (B.15.3.13) *.
B.15.3.15
Solución para detener la reacción (solución stop). Cada 6,0 mL contienen; 1,5 g
de NaF en 6,0 mL de agua *.
*
Reactivos suministrados por el fabricante
B.15.4 Procedimiento.
B.15.4.1
Preparación de las Muestras.
B.15.4.1.1
Productos Fluidos y Productos Deshidratados.
Pesar 25 g de leche deshidratada y agregar 125
mL de solución Tris 0,25 M pH 8.0 (B.15.3.1). Continuar como se indica para
leche fluida. En muestras de 5,0 mL, verificar que el pH esté en un intervalo
de 7,0-8,0. Agregar 50 mL de
aditivo (B.15.3.8). En el caso de extractos más claros, ajustar el pH a 4,0 con
HCl concentrado. Para muestras de leche de 50 mL, verificar que el pH esté en
un intervalo de 7,0-8,0. Agregar 50 mL de
aditivo (B.15.3.8). Centrifugar la muestra 10 min a 1000-3000 x g. Decantar el
extracto y pasar 5,0 mL aproximadamente, a través de una jeringa empacada con
algodón absorbente humedecido previamente, y recibir en un tubo de
polipropileno. Ajustar nuevamente el pH a 7,0-8,0 (usar papel pH). Agregar 50 mL de aditivo
(B.15.3.8) y mezclar.
B.15.4.1.2
Ingredientes Deshidratados.
Agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH
8,0 a 25 g de muestra, homogeneizar en licuadora (a velocidad alta), durante 3
min. Centrifugar la muestra 10 min a 1000-3000 x g y recoger el extracto
(sobrenadante). Quitar el émbolo de la jeringa de plástico que contiene el
empaque de algodón absorbente humedecido previamente y con cuidado, pasar el
extracto a través del empaque y recibir el eluido. Tomar 5,0 mL de eluido y
ajustar el pH a 7,0-8,0. Agregar 50 mL de
aditivo, y mezclar.
B.15.4.1.3
Quesos.
Agregar 50 mL de agua a 25 g de muestra y
homogeneizar en licuadora durante 3 min a velocidad alta. Ajustar, con HCl
concentrado, a pH 4 (usar papel pH). Centrifugar la muestra durante 10 min a
1000-3000 x g. Quitar el émbolo de la jeringa de plástico que contiene el empaque
de algodón absorbente humedecido previamente, y pasar 5 mL del extracto a la
jeringa. Insertar el émbolo y con cuidado pasar el extracto a través del
empaque y recibir el eluido. Tomar 5 mL del eluido, y agregar solución de NaOH
para ajustar a pH 7,0-8,0; agregar 50 mL de
aditivo, y mezclar.
B.15.4.1.4
Otros Alimentos.
Agregar 50 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0
a 25 g de muestra, y homogeneizar en licuadora durante 3 min a velocidad alta.
Centrifugar la muestra durante 10 min a 1000-3000 x g. Quitar el émbolo de la
jeringa de plástico que contiene el empaque de algodón absorbente humedecido
previamente, y pasar 5,0 mL de extracto a la jeringa, insertar el émbolo y con
cuidado presionar el émbolo y recoger el eluido. Tomar 5 mL del eluido, ajustar
a pH 7,0-8,0, si es necesario; agregar 50 mL de aditivo, y mezclar.
Nota 1:
Preparar los extractos de alimentos inmediatamente antes de realizar la
prueba.
Precauciones
Generales:
En caso de alimentos crudos fermentados,
procesados o enlatados, con evidentes defectos; o de cultivos fluidos obtenidos
en el laboratorio, que pudieran dar como resultado el crecimiento de
microorganismos productores de peroxidasa, es necesario, antes de hacer la
determinación de toxina, verificar si los extractos de alimentos o preparados a
partir del cultivo en el laboratorio, contienen peroxidasa, debido a que esta
enzima podría interferir con la interpretación de los resultados.
Para determinar la presencia de peroxidasa,
agregar 50 mL del
substrato (B.15.3.14.), en una placa de microtitulación sin tratar (no contiene
anticuerpos para la enterotoxina estafilocóccica). Dejar en reposo 10 min. Si
el color cambia a azul o azulverdoso, indica que la muestra contiene peroxidasa
intrínseca; la cual debe inactivarse. Si la muestra permanece incolora (o con
el color original), realizar el análisis de enterotoxina. Para inactivar la
peroxidasa intrínseca, preparar una solución al 30% (m/v) de azida de sodio y
agregar 1 mL de esta solución a 4 mL de muestra (la concentración final de la
azida de sodio es de 6% (m/v). Mezclar y agregar un poco de aditivo (B.15.3.8), dejar en reposo 1-2 min a
temperatura del laboratorio (20-25ºC). Repetir la prueba para determinar
presencia de peroxidasa, como se describió anteriormente. Si la reacción es
incolora o presenta el color original, continuar con la prueba.
Nota 2:
Para alimentos crudos (ejemplo: verduras), seguir las precauciones
generales señaladas anteriormente.
B.15.4.2
Preparación de Reactivos.
B.15.4.2.1
Reconstitución de la Solución de Lavado.
Diluir, en un frasco de reactivos la
solución concentrada (como lo indique el fabricante), con agua destilada o
deionizada, para obtener 2 L. Utilizar esta "solución de lavado" para
lavar los pozos y diluir el control positivo. Es recomendable el uso de pizeta.
Almacenar a 4°C, cuando no se use.
B.15.4.2.2
Preparación del Conjugado.
Agregar el diluyente del conjugado y
rehidratar a temperatura del laboratorio. Mezclar suavemente. Esta preparación es el "Conjugado
reconstituido".
B.15.4.2.3
Preparación del Substrato.
Disolver el substrato con el diluyente
(B.15.3.13), asegurarse que el contenido se haya disuelto completamente. Dejar
a la temperatura del laboratorio (20-25°C), antes de su uso.
B. 15.4.2.4 Precauciones generales:
u
Observar la fecha de caducidad del equipo adquirido. Es la última fecha en la
cual el producto debe utilizarse. Preparar todos los reactivos con cuidado y
anotar la fecha de reconstitución, en la etiqueta externa de la caja. Usar los
reactivos dentro de los 65 días a la fecha anotada en la etiqueta. Refrigerar
todos los componentes (2-8°C) cuando no estén en uso. NO CONGELAR.
u El
equipo de inmunoensayo visual está preparado para utilizarse como una unidad
integral; por tanto, no se deben mezclar los componentes de diferentes lotes.
u Utilizar
puntas nuevas para cada muestra de alimento. Evitar la contaminación cruzada al
llenar los pozos. Si se usan propipetas de plástico para distribuir el
conjugado y el substrato, se deben mantener siempre por separado. Asegurarse de
no confundir las tapas de los reactivos.
u Usar
controles positivos y negativos en cada prueba.
u
Preparar recipientes con solución al 2% de hipoclorito de sodio para desechar
todas las muestras y materiales que contengan toxina.
u
Mantener los pozos removibles que no se usen dentro del paquete y volver a
sellar con cinta, después de cada uso.
B.15.4.3
Determinación de la Enterotoxina.
B.15.4.3.1
Preparación de los pozos.
Tomar del paquete el número necesario de
pozos; uno para cada muestra, uno para control positivo y uno para control
negativo. Si se requiere, pueden utilizarse pozos adicionales (control positivo
y negativo en alimento).
B.15.4.3.2
Prelavado.
Con la ayuda de una pizeta llenar cada pozo
con solución de lavado y dejar en reposo durante 10 minutos a la temperatura de
laboratorio (20-25ºC). Vaciar los pozos por inversión rápida del soporte
(placa); eliminar completamente todo residuo de líquido, golpeando varias
veces, firmemente hacia abajo la placa, sobre una toalla de papel absorbente.
B.15.4.3.3
Colocación de las Muestras.
Pasar alícuotas de 200 mL de los controles
y muestras (extractos de alimento o de cultivos) dentro de pozos individuales.
Registrar la posición de cada muestra en la hoja de registro específica.
Golpear suavemente la placa para asegurarse de la distribución homogénea y del
contacto de las muestras con las paredes de los pozos; el uso de un agitador de
microplacas durante 30 segundos, es opcional. Cubrir los pozos con una película
plástica, estirable, autoadherible o sello especial de microplacas; para evitar
la evaporación. Incubar 2 hrs. a 35-37°C.
B.15.4.3.4
Segundo Lavado.
Presionar firmemente los pozos en la placa e
invertir rápidamente. Vaciar el contenido de los pozos en el recipiente de
desecho (con hipoclorito de sodio al 2%). Eliminar el residuo de líquido
golpeando enérgicamente, varias veces la placa invertida, sobre una toalla de
papel absorbente; llenar completamente los pozos con solución de lavado, y
repetir el lavado en la misma forma, de 2 a 3 veces más y finalmente vaciar los
pozos.
Nota 3:
El lavado profundo de los pozos es un paso crítico y asegurará una clara
interpretación de los resultados.
B.15.4.3.5
Adición de Conjugado.
Agregar 200 mL del conjugado reconstituido (enzima) a cada pozo.
Volver a cubrir la placa e incubar 1 h a temperatura de laboratorio (20-25°C).
Vaciar las placas y lavar profundamente, 5 veces, como se describió
anteriormente (B.16.4.3.4).
B.15.4.3.6
Adición del Substrato.
Agregar, a cada pozo, 200 mL del substrato
reconstituido. Dejar a temperatura del laboratorio (20-25°C) durante 30 min,
como mínimo, hasta que el control positivo alcance la máxima absorbancia (mayor
a 1,0) o al color más intenso que el número 4 del comparador de color. El
desarrollo de color tiende a concentrarse alrededor de las orillas de los
pozos. Para obtener resultados más precisos, golpee con suavidad los extremos
de la placa, con el propósito de que el contenido de los pozos se mezcle bien
antes de la lectura. Agregar a cada pozo 20 mL de solución stop; golpear con suavidad, para
mezclar los contenidos.
B.15.4.3.7
Determinar los Resultados visualmente o mediante un Lector de Microtitulación.
B.15.5
Interpretación de los Resultados:
B.15.5.1
Colocar la placa que sostiene los pozos sobre un fondo blanco. Comparar el
color de cada pozo con el comparador de color. El control positivo de toxina (y
el control positivo de alimento, si se usó) deben dar un color verde intenso,
lo que indica que todos los reactivos han funcionado. Si el control negativo es
significativamente más oscuro que el representado en comparador de color,
significa que hubo, probablemente, un lavado inadecuado y la prueba debe
repetirse.
B.15.5.2
La muestra se considera positiva,
si cumple los siguientes criterios:
· El
control negativo está dentro del intervalo de color negativo, representado en
el comparador de color, y
· Las
muestras presentan un color verde o azul más oscuro que el intervalo negativo
representado en el comparador de color.
B.15.5.3 La prueba de
enterotoxina se considera negativa,
si se cumplen los siguientes criterios:
· El control
negativo está dentro del intervalo de color negativo, representado en el
comparador de color, y
· La muestra es
incolora o tiene el color dentro del intervalo negativo, representado en el
comparador de color.
B.15.6 Expresión de Resultados.
|
Prueba positiva
o negativa para enterotoxina estafilocóccica |
Cuando
se obtengan resultados positivos, éstos tendrán que ser confirmados por el
método de doble difusión en gel en laminilla, establecido en el numeral 11 de este apéndice.
B.16. Método para la Cuenta de Bacterias
Aerobias en Placa.
B.16.1 Introducción
Cuando
se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento,
la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta técnica
no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad
de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales,
temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que
el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente
presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el
adecuado.
Por
otra parte el recuento de termofílicos, psicrofílicos y psicotróficos es
importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes
condiciones de almacenamiento.
Para
obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma
importancia seguir fielmente y controlar cuidadosamente las condiciones.
Esta
técnica puede aplicarse para la estimación de microorganismos viables en una
amplia variedad de alimentos.
B.16.2 Fundamento
El
fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en
el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación,
presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo
estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas
controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
B.16.3 Reactivos
Los
reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico.
Cuando
se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la
neutralidad.
B.16.4 Medio de Cultivo.
B.16.4.1 Agar Triptona-Extracto de Levadura
(agar para cuenta estándar).
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de
levadura |
2,5 g |
|
Triptona |
5,0 g |
|
Dextrosa |
1,0 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación del Medio de Cultivo.
Suspender
los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total
disolución.
Distribuir
en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 mL,
cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en
autoclave a 121 ± 1,0ºC, durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7,0
± 0,2 a 25ºC.
Si el
medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño
de agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe
de fundirse más de una vez.
En caso
de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.
El
medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos
en particular se requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar
al describir la técnica para ese alimento.
B.16.5 Materiales
Todo el
material que tenga contacto con las muestras o los microorganismos debe estar
estéril.
Se
requiere, los materiales mencionados numeral 9, Preparación y Dilución de
Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.
B.16.6
Aparatos e Instrumentos
B.16.6.1 Incubadora con termostato que evite
variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro calibrado.
B.16.6.2 Contador de colonias de campo
obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadrículada y lente amplificador.
B.16.6.3 Registrador mecánico o electrónico.
B.16.6.4 Microscopio óptico.
B.16.6.5 Baño de agua con o sin circulación
mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de hasta 1,0 °C y
que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0 °C.
B.16.7
Preparación de la Muestra
Para la preparación de la muestra seguir
numeral 9, Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.
B.16.8
Procedimiento
B.16.8.1
Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la
inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan
realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos
pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.
B.16.8.2
Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según en
B.5.1 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico, en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del
inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
Dejar solidificar.
B.16.8.3
Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente
preparado como testigo de esterilidad.
B.16.8.4
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora
al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas,
no debe exceder de 20 minutos.
B.16.8.5
Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el
tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y
microorganismo de que se trate, véase el cuadro 1.
CUADRO 1
|
Grupo bacteriano |
Temperatura |
Tiempo de incubación |
|
Termofílicos
aerobios |
55 ± 2ºC |
48 ± 2 h |
|
Mesofílicos
aerobios |
35 ± 2ºC |
48 ± 2 h |
|
Psicrotróficos |
20 ± 2ºC |
3 - 5 días |
|
Psicrofílicos |
5 ± 2ºC |
7 - 10 días |
B.16.8.6
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250
UFC, para disminuir el error en la cuenta.
B.16.8.7
Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas
(excepto las de mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer
uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir
las colonias de las pequeñas partículas de alimento.
B.16.9
Expresión de Resultados
B.16.9.1
Cálculo del Método.
i)
Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo
de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las
placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a
250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el cuadro
2, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha
dilución y reportar.
ii) Cuando
dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio
dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para
obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2.
iii) Con el
fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde
las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se
presentan las siguientes guías:
iv) Placas
con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilución
muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias
presentes en dicha dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por
el factor de dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa.
Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda "valor
estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 3.
v) Placas
con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250,
contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas
de la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una
mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2,
respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que
el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la
cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta situación agregando la
leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 4.
vi) Colonias
extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas:
vii) Cadenas de
colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la
desintegración de un cúmulo de bacterias.
viii) Colonias que se
desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.
ix) Colonias que se
desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar.
x) Colonias de
crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del
crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del
crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de la caja.
xi) Cuando es
necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están
incluidas en punto x) del numeral B.4.2.7.1,
contar cualquiera de los tipos vii), viii) o ix) del numeral B.4.2.7.1, como provenientes de una
sola fuente. En el caso de las colonias del tipo vii) del numeral B.4.2.7.1, si
la caja contiene una sola cadena, contar como una sola colonia, si la caja
contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, contar
cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena
individualmente. Las colonias del tipo vii) y ix) del numeral B.4.2.7.1, generalmente se observan
como crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los
crecimientos tipo x) del numeral B.4.2.7.1,
reportarlos como crecimiento extendido. En caso de que una dilución se
encuentre dentro del rango y otra dilución presente colonias de crecimiento
extendido, reportar la dilución en la que se pueden contar las colonias, véase
el cuadro 2, ejemplo 5
xii) Placas sin
colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias,
reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más
baja usada, véase el cuadro 2, ejemplo 6.
xiii) Placas corridas
por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más
de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado
más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del
intervalo para determinar la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 7.
xiv) Placas corridas
por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250
colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número
de colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las
cuatro placas para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 8.
xv) Placas corridas
por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y
sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro cajas
incluyendo aquélla con menos de 25 o más de 250 colonias, para calcular la
cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 9.
xvi) Después de
contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa
de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la
muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan
dos dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el
segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de la
derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer
dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el segundo
dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400):
B.16.10 Informe de la Prueba
Reportar
como: Unidades formadoras de colonias, ___ UFC/g o mL, de bacterias aerobias en
placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar,
incubadas ________ horas a _______ ºC.
CUADRO 2
Cálculo de los valores de la cuenta en placa (ensayos por duplicado)
|
Ejemplo |
|
Colonias contadas |
|
UFC/ g o mL |
|
número |
1:100 |
1:1,000 |
1:10,000 |
|
|
1 |
>250 |
178 |
16 |
180,000 |
|
|
>250 |
190 |
17 |
|
|
2 |
>250 |
220 |
25 |
250,000 |
|
3 |
18 |
2 |
0 |
1,600 |
|
|
14 |
0 |
0 |
|
|
4 |
>250 |
>250 |
512 |
5,000,000 |
|
|
>250 |
>250 |
495 |
|
|
5 |
>250 |
235 |
Crecimiento extendido |
|
|
6 |
0 |
0 |
0 |
<100 |
|
7 |
>250 |
240 |
24 |
250,000 |
|
|
>250 |
268 |
19 |
|
|
8 |
>250 |
216 |
23 |
280,000 |
|
|
>250 |
262 |
42 |
|
|
9 |
>250 |
215 |
20 |
23,000 |
|
|
>250 |
235 |
26 |
|
|
|
>250 |
275 |
32 |
270,000 |
|
|
>250 |
225 |
26 |
|
B.17 Método para la Cuenta de Mohos y
Levaduras en Alimento.
B.17.1 Fundamento
El
método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un
medio selectivo específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una
temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el crecimiento de colonias
características para este tipo de microorganismos.
B.17.2 Reactivos y materiales
B.17.2.1 Reactivos
Los
reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando
se indique agua debe entenderse como agua destilada.
i) Medios de cultivo.
Agar papa - dextrosa, comercialmente
disponible en forma deshidratada.
Preparación
del medio de cultivo.
Seguir
instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua
a 45 ± 1°C, acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10%
(aproximadamente 1,4 mL de ácido tartárico por 100 mL de medio). Después de
adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro. Dejar
solidificar una porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado.
A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después
de agregar el ácido tartárico.
B.17.2.1.1 Soluciones.
i) Solución reguladora de fosfatos (solución
concentrada)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Fosfato de potasio monobásico |
34,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver
el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.
Llevar
a 1,0 l de agua.
Esterilizar
a 121°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar
1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1,0 l con agua (solución de
trabajo).
Distribuir
en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilizar
a 121 ± 1°C durante 15 minutos.
ii) Solución estéril de ácido tartárico al
10%
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Acido tartárico |
10 g |
|
Agua destilada |
100, mL |
Preparación:
Disolver
el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por filtración
a través de membrana de 0,45 mm.
B.17.2.2 Materiales.
B.17.2.2.1
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL(o si es necesario de 1 mL y 2
mL), con tapón de algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes
iguales a una décima de su volumen total.
B.17.2.2.2
Cajas Petri.
B.17.2.2.3
Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.
B.17.2.2.4
Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
B.17.2.2.5
Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas,
tijeras, cucharas, espátulas, etc.
B.17.2.2.6
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo
estudio, deben esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o
autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
B.17.2.3 Aparatos e Instrumentos
B.17.2.3.1 Horno para
esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
B.17.2.3.2 Incubadora
con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro
calibrado.
B.17.2.3.3 Autoclave que alcance una
temperatura mínima de 121 ± 1,0°C.
B.17.2.3.4
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con
termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45
± 1,0°C.
B.17.2.3.5
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador.
B.17.2.3.6
Registrador mecánico o electrónico.
B.17.2.3.7
Microscopio óptico.
B.17.2.3.8
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
B.17.3 Preparación de la Muestra
La
preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo señalado en el numeral B.4.1
(Procedimiento para la preparación y dilución de muestras de alimentos para su
análisis microbiológico) de este apéndice normativo
B.17.3.1 Procedimiento
B.17.3.1.1 Colocar por
duplicado en cajas Petri 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución
primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
B.17.3.1.2 Repetir el
procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar,
utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
B.17.3.1.3 Verter de 15 a 20
mL de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un
baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución
primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de
20 minutos.
B.17.3.1.4 Mezclar
cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el
sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de
atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.
B.17.31.5 Preparar una caja
control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad.
B.17.3.1.6 Invertir las cajas
y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.
B.17.3.1.7 Contar las
colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5
días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si
alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil
contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y
aun de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en
los resultados del análisis.
B.17.3.1.8 Si es necesario,
cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente
para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.
B.17.4 Expresión de Resultados
Cálculo
del Método
Considerar
las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe.
Multiplicar
por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios del
numeral B.4.2 de este apéndice (Método para la cuenta de bacterias aerobias en
placa), para la expresión de resultados.
B.17.5 Informe de la Prueba
Informar:
Unidades
formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa
dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades
formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de levaduras en agar
papadextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
B.18. Estimación de la Densidad Microbiana
por la Técnica del Número Mas Probable de Bacterias Coliformes, Coliformes
fecales y Escherichia coli, por la
Técnica de Diluciones en Tubo Múltiple.
Este método es aplicable a cualquier grupo
bacteriano de interés sanitario, especialmente en productos que se encuentran
en bajas concentraciones de microorganismos (10 por gramo o mL). Ejemplo:
Leche, agua, alimentos; que por su consistencia pueden interferir con la
exactitud de la cuenta de Unidades Formadoras de Colonias (U.F.C.).
B.18.1 Fundamento.
Se basa en la dilución de la muestra en tubos
múltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor dilución sean positivos
y todos los tubos de la dilución más alta sean negativos. El resultado positivo
se demuestra por la presencia de gas o crecimiento microbiano.
Para obtener el
Número Más Probable (NMP) en los resultados se aplica la teoría de la
probabilidad, lo cual tiene como condición lo siguiente:
- Una distribución
aleatoria de las bacterias que existen en la muestra.
- Las bacterias se
encuentran como entidades no agrupadas.
- Los microorganismos
presentes en la muestra crecerán en el medio, cuando son incubados y se
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo.
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra
deberá diluirse para dar cumplimiento a las condiciones. La forma más común de
realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un inóculo en
series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A medida que el número de tubos inoculados
para cada dilución aumentan se reducen los límites de confianza.
B.18.2 Equipo,
Materiales y Reactivos.
No aplica.
B.18.3
Procedimientos.
B.18.3.1 Uso de
tablas de NMP con 95% de límite de confianza.
Las tablas 1-3 presentan la estimación estadística
de los valores del NMP que corresponden al 95% de límite de confianza cuando se
utilizan 3, 5 y 10 tubos. Otras combinaciones de resultados positivos y
negativos no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que
se presenten. Si los resultados no están incluidos en las tablas, se deberá repetir la prueba a partir de la
muestra original. Si no es posible, el NMP se puede obtener (para las
combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede aplicar una
ecuación (véase punto B.2) para obtener el NMP aproximado.
El intervalo del 95% de confianza se interpreta como
sigue: si el analista supone que el número real de microorganismos cae dentro
de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. El
valor del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto.
Cuando se preparan más de 3 diluciones de una
muestra, el NMP deberá determinarse a partir de tres diluciones consecutivas
(usando tablas 1-3). Primero, para todas las diluciones que tengan todos los
tubos positivos, seleccionar la dilución mayor. Después usar las 2 siguientes
diluciones mayores (A y B en las tablas 6 y 7). Cuando en ninguna de las
diluciones probadas hubiera crecimiento en todos los tubos, seleccionar (si es
posible) las primeras tres diluciones consecutivas (volumen de muestra) para
que la dilución media contenga resultados positivos (C de tablas 6 y 7).
Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio
con volúmenes diferentes de los enlistados en las tablas 1-5. Si el volumen de
muestra es mayor que 0,01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 10. El
resultado de una determinación de 5 tubos que dé 3 tubos positivos en 0,01 g; 2
tubos positivos en 0,001 g y 1 tubo positivo en 0,0001 g (3-2-1) leer en la
tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para así obtener 170 como el NMP
actual por gramo de muestra. De igual forma si la cantidad más grande utilizada
para la tabla de referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP derivado
de la tabla entre 10. Por ejemplo el resultado de la determinación del NMP en 3
tubos para Salmonella spp que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo
positivo en 0,1 g y ningún positivo en 0,01 g (3-1-0) leer en la tabla No. 1
como 43 y dividir entre 10, lo que da 4,3 como el NMP presuntivo por gramo de
muestra.
Un método alternativo para obtener el número más
probable es usando la siguiente fórmula:
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del
tubo de enmedio = NMP/g
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100.
B.18.3.2 Cálculo
Aproximado del NMP y 95% de límite de confianza.
Debido a la inherente complejidad para calcular los
límites de confianza del NMP lo más común es el uso de tablas. Generalmente
estas tablas están limitadas al uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso
usando un método aceptado, pueden presentarse datos irregulares o accidentes de
laboratorio que causan pérdida de 1 o más tubos de dilución. En este caso una
serie de diluciones de por ejemplo: 5,4,4 puede dar una lectura de 5-2-0. Para
estos casos se puede aplicar una fórmula sencilla, la cual no corresponde
exactamente con los resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las
desviaciones generalmente son pequeñas, esta fórmula no debe ser aplicada para
fines de regulación. La fórmula no restringe el número de tubos o las
diluciones y puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálculo aproximado
está dado por la siguiente ecuación: NMP/g = P/(N T)1/2
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la
cantidad total de muestra (g) en todos los tubos negativos y T es la
cantidad total de muestra (g) en todos los tubos.
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de
diluciones al doble:
|
MUESTRA (g) |
No. DE TUBOS |
No. DE TUBOS POSITIVOS |
|
8 4 2 1 0,5 0,25 |
5 5 5 5 5 5 |
5 4 2 0 1 0 |
El número de tubos positivos es: P = (5 + 4 + 2+ 1)
= 12; N = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + (0,25x5) = 18,25; y T
= 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)1/2 = 0,32/g o 32/100 g
Los límites de
confianza del 95% estimado, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con
la siguiente ecuación:
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n) 1/2
Donde: a es el
radio de dilución y n es el número de tubos por dilución. Esta expresión asume
que el radio de dilución es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2). Para
diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar deberá ser de 1,14(n)½ para la mejor estimación. Si el número de tubos por
dilución (ni) es desigual (por
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la dilución k reemplazar n por la
expresión nH (media armónica)
por el número de tubos por dilución (ni).
La media armónica
se define como:
nH = k / (1/ ni )
k es el número de
diluciones. Por ejemplo: Suponiendo que el resultado de 3 diluciones en ni fuera 5-4-4.
Por lo tanto nH = 3/ (1/5) + (1/4) + (1/4) ½ = 3/0,70 = 4,3i
Para el ejemplo
anterior el NMP con n = 5 y un límite de confianza aproximado de 95% será el
siguiente:
log 0,32 (1,08) (log 2)/5) ½
-0,495 0,265
Entonces el límite
inferior es el antilogaritmo (-0-76) = 0.17/g o 17/100 g y el límite inferior
es el antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100 g. Cuando se compara con las
tablas el NMP podría ser 0,31/g con límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.
Tabla No. 1 Selección del NMP con un límite de
confianza de 95% para la prueba de fermentación utilizando 3 tubos: con
porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestra.
|
No. de tubos positivos |
|
95% de límite de
confianza |
|||
|
0,1 |
0,01 |
0,001 |
NMP/g (mL)b |
Inferior |
Superior |
|
0 |
0 |
0 |
3 |
- |
- |
|
0 |
1 |
0 |
3+ |
1 |
17 |
|
1 |
0 |
0 |
4 |
1 |
21 |
|
1 |
0 |
1 |
7+ |
2 |
27 |
|
1 |
1 |
0 |
7 |
2 |
28 |
|
1 |
2 |
0 |
11+ |
4 |
35 |
|
2 |
0 |
0 |
9 |
2 |
38 |
|
2 |
0 |
1 |
14+ |
5 |
48 |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
5 |
50 |
|
2 |
1 |
1 |
20+ |
7 |
60 |
|
2 |
2 |
0 |
21 |
8 |
62 |
|
3 |
0 |
0 |
23 |
9 |
130 |
|
3 |
0 |
1 |
39 |
10 |
180 |
|
3 |
1 |
0 |
43 |
10 |
210 |
|
3 |
1 |
1 |
75 |
20 |
280 |
|
3 |
2 |
0 |
93 |
30 |
380 |
|
3 |
2 |
1 |
150 |
50 |
500 |
|
3 |
2 |
2 |
210+ |
80 |
640 |
|
3 |
3 |
0 |
240 |
90 |
1400 |
|
3 |
3 |
1 |
460 |
100 |
2400 |
|
3 |
3 |
2 |
1100 |
300 |
4800 |
|
3 |
3 |
3 |
1100 |
- |
- |
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas no están
seguidos por un símbolo más (+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas
obtenidos están marcados por un símbolo más (+). Combinaciones de tubos
positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o
que el valor del número más probable se encuentra en el límite. El NMP de
combinaciones que no aparecen en la tabla, se puede obtener por extrapolación a
la combinación cercana más elevada.
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos
como NMP/100 g (mL).
Tabla No. 2 Selección del NMP con un límite de
confianza de 95% para la prueba de fermentación utilizando 5 tubos: con
porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa.
|
No. de tubos positivos |
|
95% de límite de confianza |
|||
|
0,1 |
0,01 |
0,001 |
NMP/g (mL)b |
Inferior |
Superior |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
0 |
0 |
2 |
- |
- |
|
0 |
0 |
1 |
2+ |
1 |
10 |
|
0 |
1 |
0 |
2 |
1 |
10 |
|
1 |
0 |
0 |
2 |
1 |
11 |
|
1 |
0 |
1 |
4+ |
1 |
15 |
|
1 |
1 |
0 |
4 |
1 |
15 |
|
1 |
2 |
0 |
6+ |
2 |
18 |
|
2 |
0 |
0 |
4 |
1 |
17 |
|
2 |
0 |
1 |
7+ |
2 |
20 |
|
2 |
1 |
0 |
7 |
2 |
21 |
|
2 |
1 |
1 |
9+ |
3 |
25 |
|
2 |
2 |
0 |
9 |
3 |
25 |
|
3 |
0 |
0 |
8 |
3 |
24 |
|
3 |
0 |
1 |
11 |
4 |
29 |
|
3 |
1 |
0 |
11 |
4 |
30 |
|
3 |
1 |
1 |
14+ |
6 |
35 |
|
3 |
2 |
0 |
14 |
6 |
35 |
|
3 |
2 |
1 |
17+ |
7 |
40 |
|
3 |
3 |
0 |
17+ |
7 |
41 |
|
4 |
0 |
0 |
13 |
5 |
38 |
|
4 |
0 |
1 |
17 |
7 |
45 |
|
4 |
1 |
0 |
17 |
7 |
46 |
|
4 |
1 |
1 |
21 |
9 |
55 |
|
4 |
2 |
0 |
22 |
9 |
56 |
|
4 |
2 |
1 |
26+ |
12 |
65 |
|
4 |
3 |
0 |
27 |
12 |
67 |
|
4 |
3 |
1 |
33+ |
15 |
77 |
|
4 |
4 |
0 |
34+ |
16 |
80 |
|
5 |
0 |
0 |
23 |
9 |
68 |
|
5 |
0 |
1 |
31 |
13 |
110 |
|
5 |
1 |
0 |
33 |
14 |
120 |
|
5 |
1 |
1 |
46 |
20 |
150 |
|
5 |
1 |
2 |
63+ |
22 |
180 |
|
5 |
2 |
0 |
49 |
21 |
170 |
|
5 |
2 |
1 |
70 |
30 |
210 |
|
5 |
2 |
2 |
94+ |
40 |
250 |
|
5 |
3 |
0 |
79 |
30 |
250 |
|
5 |
3 |
1 |
110 |
40 |
300 |
|
5 |
3 |
2 |
140 |
60 |
360 |
|
5 |
4 |
0 |
130 |
50 |
390 |
|
5 |
4 |
1 |
170 |
70 |
480 |
|
5 |
4 |
2 |
220 |
100 |
580 |
|
5 |
4 |
3 |
280+ |
120 |
690 |
|
5 |
4 |
4 |
350+ |
160 |
820 |
|
5 |
5 |
0 |
240 |
100 |
940 |
|
5 |
5 |
1 |
350 |
100 |
1300 |
|
5 |
5 |
2 |
540 |
220 |
2000 |
|
5 |
5 |
3 |
920 |
300 |
2900 |
|
5 |
5 |
4 |
1600 |
600 |
5300 |
|
5 |
5 |
5 |
1600 |
- |
- |
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no están
seguidos por un símbolo más(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas
obtenidos están marcados por un símbolo más (+). Combinaciones de tubos
positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o
que el valor del número más probable se encuentra en el límite. El NMP de
combinaciones que no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extrapolación
a la combinación cercana más elevada.
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100
para expresarlos como NMP/100 g (mL).
Tabla No. 3 Selección del NMP con un límite de
confianza de 95% para la prueba de fermentación utilizando 10 tubos: con
porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa.
|
No. de tubos positivos |
|
95% de límite de confianza |
|||
|
0,1 |
0,01 |
0,001 |
NMP/g (mL)b |
Inferior |
Superior |
|
0 |
0 |
0 |
1 |
- |
- |
|
0 |
0 |
1 |
1+ |
1 |
5 |
|
0 |
1 |
0 |
1 |
1 |
5 |
|
0 |
2 |
0 |
2+ |
1 |
7 |
|
1 |
0 |
0 |
1 |
1 |
5 |
|
1 |
0 |
1 |
2+ |
1 |
7 |
|
1 |
1 |
0 |
2 |
1 |
7 |
|
1 |
2 |
0 |
3+ |
1 |
8 |
|
2 |
0 |
0 |
2 |
1 |
7 |
|
2 |
0 |
1 |
3+ |
1 |
9 |
|
2 |
1 |
0 |
3 |
1 |
9 |
|
2 |
1 |
1 |
4+ |
1 |
10 |
|
2 |
2 |
0 |
4 |
2 |
10 |
|
2 |
3 |
0 |
5+ |
2 |
12 |
|
3 |
0 |
0 |
3 |
1 |
9 |
|
3 |
0 |
1 |
4 |
2 |
11 |
|
3 |
1 |
0 |
4 |
2 |
11 |
|
3 |
1 |
1 |
5+ |
2 |
13 |
|
3 |
2 |
0 |
5 |
2 |
13 |
|
3 |
2 |
1 |
6+ |
3 |
14 |
|
3 |
3 |
0 |
6+ |
3 |
14 |
|
4 |
0 |
0 |
4 |
2 |
12 |
|
4 |
0 |
1 |
6 |
2 |
13 |
|
4 |
1 |
0 |
6 |
2 |
14 |
|
4 |
1 |
1 |
7 |
3 |
15 |
|
4 |
2 |
0 |
7 |
3 |
15 |
|
4 |
2 |
1 |
8 |
4 |
17 |
|
4 |
3 |
0 |
8 |
4 |
17 |
|
4 |
4 |
0 |
9+ |
5 |
19 |
|
5 |
0 |
0 |
6 |
2 |
15 |
|
5 |
0 |
1 |
7 |
3 |
16 |
|
5 |
1 |
0 |
7 |
3 |
17 |
|
5 |
1 |
1 |
9 |
4 |
18 |
|
5 |
2 |
0 |
9 |
4 |
18 |
|
5 |
2 |
1 |
10+ |
5 |
20 |
|
5 |
3 |
0 |
10 |
5 |
20 |
|
5 |
3 |
1 |
11+ |
6 |
22 |
|
5 |
4 |
0 |
11+ |
6 |
22 |
|
6 |
0 |
0 |
8 |
3 |
18 |
|
6 |
0 |
1 |
9 |
4 |
20 |
|
6 |
1 |
0 |
9 |
4 |
20 |
|
6 |
1 |
1 |
11 |
5 |
22 |
|
6 |
2 |
0 |
11 |
5 |
22 |
|
6 |
2 |
1 |
12 |
6 |
24 |
|
6 |
3 |
0 |
12 |
6 |
25 |
|
6 |
3 |
1 |
14+ |
7 |
27 |
|
6 |
4 |
0 |
14+ |
7 |
27 |
|
6 |
5 |
0 |
15+ |
8 |
29 |
|
7 |
0 |
0 |
10 |
5 |
22 |
|
7 |
0 |
1 |
12 |
6 |
24 |
|
7 |
0 |
2 |
13+ |
7 |
27 |
|
7 |
1 |
0 |
12 |
6 |
25 |
|
7 |
1 |
1 |
13 |
7 |
27 |
|
7 |
1 |
2 |
15+ |
8 |
30 |
|
7 |
2 |
0 |
13 |
7 |
27 |
|
7 |
2 |
1 |
15 |
8 |
30 |
|
7 |
2 |
2 |
17+ |
9 |
32 |
|
7 |
3 |
0 |
15 |
8 |
30 |
|
7 |
3 |
1 |
17 |
9 |
33 |
|
7 |
4 |
0 |
17 |
9 |
33 |
|
7 |
4 |
1 |
19+ |
10 |
36 |
|
7 |
5 |
0 |
19+ |
10 |
36 |
|
8 |
0 |
0 |
13 |
6 |
28 |
|
8 |
0 |
1 |
15 |
7 |
31 |
|
8 |
0 |
2 |
17+ |
8 |
34 |
|
8 |
1 |
0 |
15 |
7 |
31 |
|
8 |
1 |
1 |
17 |
9 |
34 |
|
8 |
1 |
2 |
19+ |
10 |
37 |
|
8 |
2 |
0 |
17 |
9 |
35 |
|
8 |
2 |
1 |
19 |
10 |
38 |
|
8 |
2 |
2 |
21+ |
12 |
42 |
|
8 |
3 |
0 |
19 |
10 |
39 |
|
8 |
3 |
1 |
21 |
12 |
42 |
|
8 |
3 |
2 |
24+ |
13 |
46 |
|
8 |
4 |
0 |
22 |
12 |
43 |
|
8 |
4 |
1 |
24 |
13 |
46 |
|
8 |
5 |
0 |
24 |
13 |
47 |
|
8 |
5 |
1 |
27+ |
15 |
51 |
|
8 |
6 |
0 |
27+ |
15 |
52 |
|
9 |
0 |
0 |
17 |
8 |
37 |
|
9 |
0 |
1 |
19 |
10 |
41 |
|
9 |
0 |
2 |
22+ |
11 |
46 |
|
9 |
1 |
0 |
19 |
10 |
42 |
|
9 |
1 |
1 |
22 |
11 |
47 |
|
9 |
1 |
2 |
25+ |
13 |
52 |
|
9 |
2 |
0 |
22 |
12 |
47 |
|
9 |
2 |
1 |
25 |
13 |
53 |
|
9 |
2 |
2 |
28+ |
15 |
58 |
|
9 |
3 |
0 |
25 |
13 |
54 |
|
9 |
3 |
1 |
29 |
15 |
60 |
|
9 |
3 |
2 |
32+ |
18 |
66 |
|
9 |
4 |
0 |
29 |
16 |
61 |
|
9 |
4 |
1 |
33 |
18 |
67 |
|
9 |
4 |
2 |
37+ |
20 |
74 |
|
9 |
5 |
0 |
33 |
18 |
69 |
|
9 |
5 |
1 |
37 |
20 |
76 |
|
9 |
5 |
2 |
42+ |
23 |
83 |
|
9 |
6 |
0 |
38 |
21 |
77 |
|
9 |
6 |
1 |
43+ |
24 |
85 |
|
9 |
7 |
0 |
44+ |
24 |
87 |
|
10 |
0 |
0 |
23 |
12 |
58 |
|
10 |
0 |
1 |
27 |
14 |
67 |
|
10 |
0 |
2 |
31+ |
16 |
77 |
|
10 |
1 |
0 |
27 |
14 |
69 |
|
10 |
1 |
1 |
32 |
17 |
79 |
|
10 |
1 |
2 |
38 |
20 |
92 |
|
10 |
2 |
0 |
33 |
17 |
83 |
|
10 |
2 |
1 |
39 |
20 |
96 |
|
10 |
2 |
2 |
50 |
20 |
110 |
|
10 |
2 |
3 |
50+ |
30 |
120 |
|
10 |
3 |
0 |
40 |
20 |
100 |
|
10 |
3 |
1 |
50 |
20 |
120 |
|
10 |
3 |
2 |
60+ |
30 |
130 |
|
10 |
3 |
3 |
70+ |
30 |
150 |
|
10 |
4 |
0 |
50 |
30 |
120 |
|
10 |
4 |
1 |
60 |
30 |
140 |
|
10 |
4 |
2 |
70 |
30 |
160 |
|
10 |
4 |
3 |
80+ |
40 |
170 |
|
10 |
5 |
0 |
60 |
30 |
150 |
|
10 |
5 |
1 |
70 |
40 |
170 |
|
10 |
5 |
2 |
90 |
40 |
190 |
|
10 |
5 |
3 |
100 |
50 |
210 |
|
10 |
6 |
0 |
80 |
40 |
180 |
|
10 |
6 |
1 |
90 |
50 |
200 |
|
10 |
6 |
2 |
110 |
50 |
230 |
|
10 |
6 |
3 |
120 |
60 |
250 |
|
10 |
6 |
4 |
140+ |
70 |
270 |
|
10 |
7 |
0 |
100 |
50 |
220 |
|
10 |
7 |
1 |
120 |
60 |
250 |
|
10 |
7 |
2 |
140 |
70 |
280 |
|
10 |
7 |
3 |
150 |
80 |
310 |
|
10 |
7 |
4 |
170+ |
90 |
340 |
|
10 |
8 |
0 |
130 |
60 |
280 |
|
10 |
8 |
1 |
150 |
80 |
320 |
|
10 |
8 |
2 |
170 |
90 |
360 |
|
10 |
8 |
3 |
200 |
100 |
400 |
|
10 |
8 |
4 |
220 |
120 |
440 |
|
10 |
8 |
5 |
250+ |
140 |
480 |
|
10 |
9 |
0 |
170 |
90 |
380 |
|
10 |
9 |
1 |
200 |
100 |
430 |
|
10 |
9 |
2 |
230 |
120 |
490 |
|
10 |
9 |
3 |
260 |
140 |
560 |
|
10 |
9 |
4 |
300 |
160 |
640 |
|
10 |
9 |
5 |
350 |
180 |
720 |
|
10 |
9 |
6 |
400+ |
210 |
820 |
|
10 |
10 |
0 |
240 |
120 |
610 |
|
10 |
10 |
1 |
290 |
150 |
750 |
|
10 |
10 |
2 |
350 |
170 |
910 |
|
10 |
10 |
3 |
400 |
200 |
1100 |
|
10 |
10 |
4 |
500 |
300 |
1400 |
|
10 |
10 |
5 |
700 |
300 |
1700 |
|
10 |
10 |
6 |
900 |
400 |
2100 |
|
10 |
10 |
7 |
1120 |
600 |
2700 |
|
10 |
10 |
8 |
1160 |
800 |
3700 |
|
10 |
10 |
9 |
2300 |
1100 |
6000 |
|
10 |
10 |
10 |
2300 |
- |
- |
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no están
seguidos por un símbolo más (+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas
obtenidos están marcados por un símbolo más(+). Combinaciones de tubos
positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o que el valor del número más
probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en
la tabla, se pueden obtener por extrapolación a la combinación cercana más
elevada.
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos
como NMP/100 g (mL).
Tabla No. 4 Número más probable (NMP) para 1g de
muestra cuando se usan 3 tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001g.
|
Tubos Positivos |
Tubos Positivos |
Tubos Positivos |
Tubos Positivos |
||||||||||||
|
0,1 |
0,01 |
0,001 |
NMP |
0,1 |
0,01 |
0,001 |
NMP |
0,1 |
0,01 |
0,001 |
NMP |
0,1 |
0,01 |
0,001 |
NMP |
|
0 |
0 |
0 |
3 |
1 |
0 |
0 |
3,6 |
2 |
0 |
0 |
9,1 |
3 |
0 |
0 |
23 |
|
0 |
0 |
1 |
3 |
1 |
0 |
1 |
7,2 |
2 |
0 |
1 |
14 |
3 |
0 |
1 |
39 |
|
0 |
0 |
2 |
6 |
1 |
0 |
2 |
11 |
2 |
0 |
2 |
20 |
3 |
0 |
2 |
64 |
|
0 |
0 |
3 |
9 |
1 |
0 |
3 |
15 |
2 |
0 |
3 |
26 |
3 |
0 |
3 |
95 |
|
0 |
1 |
0 |
3 |
1 |
1 |
0 |
7,3 |
2 |
1 |
0 |
15 |
3 |
1 |
0 |
43 |
|
0 |
1 |
1 |
6,1 |
1 |
1 |
1 |
11 |
2 |
1 |
1 |
20 |
3 |
1 |
1 |
75 |
|
0 |
1 |
2 |
9,2 |
1 |
1 |
2 |
15 |
2 |
1 |
2 |
27 |
3 |
1 |
2 |
120 |
|
0 |
1 |
3 |
12 |
1 |
1 |
3 |
19 |
2 |
1 |
3 |
34 |
3 |
1 |
3 |
160 |
|
0 |
2 |
0 |
6,2 |
1 |
2 |
0 |
11 |
2 |
2 |
0 |
21 |
3 |
2 |
0 |
93 |
|
0 |
2 |
1 |
9,3 |
1 |
2 |
1 |
15 |
2 |
2 |
1 |
28 |
3 |
2 |
1 |
150 |
|
0 |
2 |
2 |
12 |
1 |
2 |
2 |
20 |
2 |
2 |
2 |
35 |
3 |
2 |
2 |
210 |
|
0 |
2 |
3 |
16 |
1 |
2 |
3 |
24 |
2 |
2 |
3 |
42 |
3 |
2 |
3 |
290 |
|
0 |
3 |
0 |
9,4 |
1 |
3 |
0 |
16 |
2 |
3 |
0 |
29 |
3 |
3 |
0 |
240 |
|
0 |
3 |
1 |
13 |
1 |
3 |
1 |
20 |
2 |
3 |
1 |
36 |
3 |
3 |
1 |
460 |
|
0 |
3 |
2 |
16 |
1 |
3 |
2 |
24 |
2 |
3 |
2 |
44 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
|
0 |
3 |
3 |
19 |
1 |
3 |
3 |
29 |
2 |
3 |
3 |
53 |
3 |
3 |
3 |
1100 |
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 mL de
muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de 3 diluciones con series
geométricas.
|
No.
de Tubos Positivos |
No.
de Tubos Positivos |
No.
de Tubos Positivos |
No.
de Tubos Positivos |
No.
de Tubos Positivos |
No.
de Tubos Positivos |
||||||||||||||||||
|
10 1 0,1 |
10 1 0,1 |
10 1 0,1 |
10 1 0,1 |
10 1 0,1 |
10 1 0,1 |
||||||||||||||||||
|
mL |
mL |
mL |
N M P |
mL |
mL |
mL |
N M P |
mL |
mL |
mL |
N M P |
mL |
mL |
mL |
N M P |
mL |
mL |
mL |
N M P |
mL |
mL |
mL |
N M P |
|
0 |
0 |
0 |
|
1 |
0 |
0 |
2 |
2 |
0 |
0 |
4,5 |
3 |
0 |
0 |
7,8 |
4 |
0 |
0 |
13 |
5 |
0 |
0 |
23 |
|
0 |
0 |
1 |
1,8 |
1 |
0 |
1 |
4 |
2 |
0 |
1 |
6,8 |
3 |
0 |
1 |
11 |
4 |
0 |
1 |
17 |
5 |
0 |
1 |
31 |
|
0 |
0 |
2 |
3,6 |
1 |
0 |
2 |
6 |
2 |
0 |
2 |
9,1 |
3 |
0 |
2 |
13 |
4 |
0 |
2 |
21 |
5 |
0 |
2 |
43 |
|
0 |
0 |
3 |
5,4 |
1 |
0 |
3 |
8 |
2 |
0 |
3 |
12 |
3 |
0 |
3 |
16 |
4 |
0 |
3 |
25 |
5 |
0 |
3 |
58 |
|
0 |
0 |
4 |
7,2 |
1 |
0 |
4 |
10 |
2 |
0 |
4 |
14 |
3 |
0 |
4 |
20 |
4 |
0 |
4 |
30 |
5 |
0 |
4 |
76 |
|
0 |
0 |
5 |
9,0 |
1 |
0 |
5 |
12 |
2 |
0 |
5 |
16 |
3 |
0 |
5 |
23 |
4 |
0 |
5 |
36 |
5 |
0 |
5 |
95 |
|
0 |
1 |
0 |
1,8 |
1 |
1 |
0 |
4 |
2 |
1 |
0 |
6,8 |
3 |
1 |
0 |
11 |
4 |
1 |
0 |
17 |
5 |
1 |
0 |
33 |
|
0 |
1 |
1 |
3,6 |
1 |
1 |
1 |
6,1 |
2 |
1 |
1 |
9,2 |
3 |
1 |
1 |
14 |
4 |
1 |
1 |
21 |
5 |
1 |
1 |
46 |
|
0 |
1 |
2 |
5,5 |
1 |
1 |
2 |
8,1 |
2 |
1 |
2 |
12 |
3 |
1 |
2 |
17 |
4 |
1 |
2 |
26 |
5 |
1 |
2 |
64 |
|
0 |
1 |
3 |
7,3 |
1 |
1 |
3 |
10 |
2 |
1 |
3 |
14 |
3 |
1 |
3 |
20 |
4 |
1 |
3 |
31 |
5 |
1 |
3 |
84 |
|
0 |
1 |
4 |
9,1 |
1 |
1 |
4 |
12 |
2 |
1 |
4 |
17 |
3 |
1 |
4 |
23 |
4 |
1 |
4 |
35 |
5 |
1 |
4 |
110 |
|
0 |
1 |
5 |
11 |
1 |
1 |
5 |
14 |
2 |
1 |
5 |
19 |
3 |
1 |
5 |
27 |
4 |
1 |
5 |
42 |
5 |
1 |
5 |
130 |
|
0 |
2 |
0 |
3,7 |
1 |
2 |
0 |
6,1 |
2 |
2 |
0 |
9,3 |
3 |
2 |
0 |
14 |
4 |
2 |
0 |
22 |
5 |
2 |
0 |
49 |
|
0 |
2 |
1 |
5,5 |
1 |
2 |
1 |
8,2 |
2 |
2 |
1 |
12 |
3 |
2 |
1 |
17 |
4 |
2 |
1 |
26 |
5 |
2 |
1 |
70 |
|
0 |
2 |
2 |
7,4 |
1 |
2 |
2 |
10 |
2 |
2 |
2 |
14 |
3 |
2 |
2 |
20 |
4 |
2 |
2 |
32 |
5 |
2 |
2 |
95 |
|
0 |
2 |
3 |
9,2 |
1 |
2 |
3 |
12 |
2 |
2 |
3 |
17 |
3 |
2 |
3 |
24 |
4 |
2 |
3 |
38 |
5 |
2 |
3 |
120 |
|
0 |
2 |
4 |
11 |
1 |
2 |
4 |
15 |
2 |
2 |
4 |
19 |
3 |
2 |
4 |
27 |
4 |
2 |
4 |
44 |
5 |
2 |
4 |
150 |
|
0 |
2 |
5 |
13 |
1 |
2 |
5 |
17 |
2 |
2 |
5 |
22 |
3 |
2 |
5 |
31 |
4 |
2 |
5 |
50 |
5 |
2 |
5 |
180 |
|
0 |
3 |
0 |
5,6 |
1 |
3 |
0 |
8,3 |
2 |
3 |
0 |
12 |
3 |
3 |
0 |
17 |
4 |
3 |
0 |
27 |
5 |
3 |
0 |
79 |
|
0 |
3 |
1 |
7,4 |
1 |
3 |
1 |
10 |
2 |
3 |
1 |
14 |
3 |
3 |
1 |
21 |
4 |
3 |
1 |
33 |
5 |
3 |
1 |
110 |
|
0 |
3 |
2 |
9,3 |
1 |
3 |
2 |
13 |
2 |
3 |
2 |
17 |
3 |
3 |
2 |
24 |
4 |
3 |
2 |
39 |
5 |
3 |
2 |
140 |
|
0 |
3 |
3 |
11 |
1 |
3 |
3 |
15 |
2 |
3 |
3 |
20 |
3 |
3 |
3 |
28 |
4 |
3 |
3 |
45 |
5 |
3 |
3 |
180 |
|
0 |
3 |
4 |
13 |
1 |
3 |
4 |
17 |
2 |
3 |
4 |
22 |
3 |
3 |
4 |
31 |
4 |
3 |
4 |
52 |
5 |
3 |
4 |
210 |
|
0 |
3 |
5 |
15 |
1 |
3 |
5 |
19 |
2 |
3 |
5 |
25 |
3 |
3 |
5 |
35 |
4 |
3 |
5 |
59 |
5 |
3 |
5 |
250 |
|
0 |
4 |
0 |
7,5 |
1 |
4 |
0 |
11 |
2 |
4 |
0 |
15 |
3 |
4 |
0 |
21 |
4 |
4 |
0 |
34 |
5 |
4 |
0 |
130 |
|
0 |
4 |
1 |
9,4 |
1 |
4 |
1 |
13 |
2 |
4 |
1 |
17 |
3 |
4 |
1 |
24 |
4 |
4 |
1 |
40 |
5 |
4 |
1 |
170 |
|
0 |
4 |
2 |
11 |
1 |
4 |
2 |
15 |
2 |
4 |
2 |
20 |
3 |
4 |
2 |
28 |
4 |
4 |
2 |
47 |
5 |
4 |
2 |
220 |
|
0 |
4 |
3 |
13 |
1 |
4 |
3 |
17 |
2 |
4 |
3 |
23 |
3 |
4 |
3 |
32 |
4 |
4 |
3 |
54 |
5 |
4 |
3 |
280 |
|
0 |
4 |
4 |
15 |
1 |
4 |
4 |
19 |
2 |
4 |
4 |
25 |
3 |
4 |
4 |
36 |
4 |
4 |
4 |
62 |
5 |
4 |
4 |
350 |
|
0 |
4 |
5 |
17 |
1 |
4 |
5 |
22 |
2 |
4 |
5 |
28 |
3 |
4 |
5 |
40 |
4 |
4 |
5 |
69 |
5 |
4 |
5 |
430 |
|
0 |
5 |
0 |
9,4 |
1 |
5 |
0 |
13 |
2 |
5 |
0 |
17 |
3 |
5 |
0 |
25 |
4 |
5 |
0 |
41 |
5 |
5 |
0 |
240 |
|
0 |
5 |
1 |
11 |
1 |
5 |
1 |
15 |
2 |
5 |
1 |
20 |
3 |
5 |
1 |
29 |
4 |
5 |
1 |
48 |
5 |
5 |
1 |
350 |
|
0 |
5 |
2 |
13 |
1 |
5 |
2 |
17 |
2 |
5 |
2 |
23 |
3 |
5 |
2 |
32 |
4 |
5 |
2 |
56 |
5 |
5 |
2 |
540 |
|
0 |
5 |
3 |
15 |
1 |
5 |
3 |
19 |
2 |
5 |
3 |
26 |
3 |
5 |
3 |
37 |
4 |
5 |
3 |
64 |
5 |
5 |
3 |
920 |
|
0 |
5 |
4 |
17 |
1 |
5 |
4 |
22 |
2 |
5 |
4 |
29 |
3 |
5 |
4 |
41 |
4 |
5 |
4 |
72 |
5 |
5 |
4 |
1600 |
|
0 |
5 |
5 |
19 |
1 |
5 |
5 |
24 |
2 |
5 |
5 |
32 |
3 |
5 |
5 |
45 |
4 |
5 |
5 |
81 |
|
|
|
|
Tabla No. 6
Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de tres tubos con 1g (mL) de
muestra por tubo.
|
|
Cantidad
de muestra (g o mL)a |
Valores
positivos reportados |
NMP
estimado/g o mLb |
||||||
|
Ejemplo |
0,10 |
,001 |
0,001 |
0,0001 |
0,00001 |
|
|
||
|
A |
3/3 |
3/3 |
2/3 |
0/3 |
0/3 |
3-2-0 |
930 |
|
|
|
B |
3/3 |
3/3 |
3/3 |
2/3 |
0/3 |
3-2-0 |
9300 |
|
|
|
C |
0/3 |
0/3 |
1/3 |
0/3 |
0/3 |
0-1-0 |
30 |
|
|
|
D |
3/3 |
3/3 |
2/3 |
1/3 |
1/3 |
3-2-2 |
2100 |
|
|
|
E |
3/3 |
3/3 |
3/3 |
3/3 |
3/3 |
3-3-3 |
110000 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
a Numerador/denominador = número de tubos
positivos/número de tubos inoculados.
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100
para expresarlos como NMP/100 g (mL).
Tabla No. 7
Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de 5 tubos con 1 g (mL) de
muestra por tubo.
|
|
Cantidad
de muestra (g o mL)a |
Valores
positivos |
NMP
estimado/g o mLb |
||||||
|
Ejemplo |
0,1, |
0,01 |
0,001 |
0,0001 |
0,00001 |
reportados |
|
||
|
A |
5/5 |
5/5 |
2/5 |
0/5 |
0/5 |
5-2-0 |
490 |
|
|
|
B |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
2/5 |
0/5 |
5-2-0 |
4900 |
|
|
|
C |
0/5 |
0/5 |
1/5 |
0/5 |
0/5 |
0-1-0 |
20 |
|
|
|
D |
5/5 |
5/5 |
3/5 |
1/5 |
1/5 |
5-2-2 |
1400 |
|
|
|
E |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
5-5-5 |
160000 |
|
|
a Numerador/denominador = número de tubos
positivos/número de tubos inoculados.
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100
para expresarlos como NMP/100 g (mL).
B.18.3.3 Determinación
de Bacterias Coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli por la Técnica de Diluciones en Tubo Múltiple.
B.18.3.3.1
Fundamento
Este método se basa en la propiedad de los
microorganismos coliformes para producir gas a partir de glucosa y fermentación
de lactosa dentro de las 48 horas de incubación a 35 0,5°C (coliformes) y
44,50,2°C (coliformes fecales y E. coli).
B.18.3.3.2 Equipo y
Materiales
Además de los mencionados en el método Preparación y
dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológico, lo siguiente:
- Baño de agua con agitación continua cubierto y con
termostato que evite variaciones mayores a 0,1°C.
- Termómetro calibrado y verificado 1/10
- Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con
tapón de rosca
- Campanas de fermentación (tubos de Durham)
- Gradillas
- Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro
- Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4
watts.
- Lentes protectores.
B.18.3.3.3 Medios de
Cultivo
Caldo Lauril
Ingredientes:
|
Bacto triptosa |
20,0 g |
|
Bacto lactosa |
5,0 g |
|
Fosfato potásico, dibásico |
2,75 g |
|
Fosfato potásico, monobásico |
2,75 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Lauril sulfato de sodio |
0,1 g |
|
Agua destilada |
1000,0 mL |
pH final: 6,8 0,2 a 25°C.
Preparación:
1. Disolver los ingredientes en un litro de agua
destilada.
2. Ajustar el pH.
3. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de
Durham.
4. Adicionar 10 mL de medio para cada tubo.
5. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a
121C.
6. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la
temperatura a 75C para que no queden burbujas en las campanas de Durham.
Preparación de
Caldo Lauril Triptosa
|
INOCULO (mL) |
CANTIDAD DE
MEDIO POR TUBO (mL) |
VOLUMEN DE MEDIO
MAS INOCULO (mL) |
CALDO LAURIL
TRIPTOSA REQUERIDO g/L |
|
1 |
10 o más |
11 o más |
35,6 |
|
10 |
10 |
20 |
71,2 |
|
10 |
20 |
30 |
53,4 |
|
20 |
10 |
30 |
106,8 |
|
100 |
50 |
150 |
106,8 |
|
100 |
35 |
135 |
137,1 |
|
100 |
20 |
120 |
213,6 |
Caldo EC (E. coli.)
|
Ingredientes: |
|
|
Bacto triptosa |
20,0 g |
|
Bacto lactosa |
5,0 g |
|
Bacto sales biliares No. 3 |
1,5 g |
|
Fosfato dipotásico |
4,0 g |
|
Fosfato monopotásico |
1,5 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Agua destilada |
1000,0 mL |
pH final: 6,9 0,2 a 25°C.
Preparación:
1. Disolver los ingredientes en un litro de agua
destilada y calentar ligeramente para que se disuelva por completo.
2. Ajustar el pH.
3. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de
Durham.
4. Adicionar 10 mL de medio para cada tubo.
5. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a
121°C.
6. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la
temperatura a 75°C para evitar que queden burbujas en las campanas de Durham.
Agar McConkey
|
Ingredientes: |
|
|
Proteasa peptona o
polipeptona |
3,0 g |
|
Peptona o gelizante |
17,0 g |
|
Lactosa |
10,0 g |
|
Sales biliares No. 3 |
1,5 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Rojo neutro |
0,03 g |
|
Cristal violeta |
0,001 g |
|
Agar |
13,5 g |
|
Agua destilada |
1000,0 mL |
pH final: 7,1 0,2 a 25°C
Preparación:
1. Disolver los
ingredientes en un litro de agua destilada.
2. Calentar hasta
ebullición para disolver por completo.
3. Ajustar el pH.
4. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos.
5. Enfriar a
50-60°C y vaciar en cajas Petri.
Agar Eosina Azul de Metileno de Levin (EMB-L)
|
Ingredientes: |
|
|
Peptona |
10,0 g |
|
Lactosa |
10,0 g |
|
K2HPO4 |
2,0 g |
|
Eosina Y |
0,4 g |
|
Azul de metileno |
0,065 g |
|
Agua destilada |
1000 mL |
pH final: 7,1 0,2
1. Disolver la
peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua.
2. Calentar hasta
ebullición para la disolución completa.
3. Distribuir en
porciones de 100 o 200 mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos.
4. Fundir antes de
su uso y adicionar a cada porción de 100 mL:
a) 5 mL de
solución de lactosa al 20%
b) 2 mL de
solución acuosa de eosina al 2%
c) 4,3 mL de
solución acuosa de azul de metileno al 0,15%.
Cuando se use el
producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Caldo Triptona al 1% (triptofano)
|
Ingredientes: |
|
|
Triptona o tripticasa |
10 g |
|
Agua destilada |
1000 mL |
pH final: 6,9 0,2
1. Disolver los
ingredientes
2. Distribuir en
porciones de 5 mL en tubos de ensaye de 16 x 125 o 16 x 150 mm.
3. Esterilizar a
121°C por 15 minutos.
Caldo MR-VP
Medio 1
|
Ingredientes: |
|
|
Peptona tamponada |
7 g |
|
Glucosa |
5 g |
|
K2HPO4 |
5 g |
|
Agua destilada |
1000 mL |
pH final: 6,9 0,2
1. Disolver los
ingredientes con calentamiento suave si es necesario.
2. Distribuir en
volúmenes de 10 mL en tubos de ensaye de 16x150 mm.
3. Esterilizar a
121°C por 15 minutos.
Caldo Citrato de Koser
|
Ingredientes: |
|
|
NaNH4HPO4 4H2O |
1,5 g |
|
KH2PO4 (monobásico) |
1,0 g |
|
MgSO4 7H2O |
0,2 g |
|
Citrato de sodio 2H2O |
3,0 g |
|
Agua destilada |
1000 mL |
pH final: 6,7 0,2.
1. Distribuir
preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca.
2. Esterilizar a
121°C por 15 minutos.
Esta formulación
se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos
Estándares para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere de
la composición del medio deshidratado disponible comercialmente y es
recomendable su uso.
B.18.3.3.4 Reactivos
Reactivo de Kovacs
|
Ingredientes: |
|
|
p-imetilaminobenzaldehído |
5 g |
|
Alcohol amílico
(normal) |
75 mL |
|
HCI concentrado |
25 mL |
1. Disolver el
p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal.
2. Adicionar
lentamente el HCl. Almacenar a 4°C.
Para la prueba de
indol
1. Adicionar
0,2-0,3 mL del reactivo a 5 mL del cultivo de bacteria en caldo triptona.
Se considera una
prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo.
Reactivo de
Voges-Proskauer (VP)
Solución 1
|
Ingredientes: |
|
|
alfa-naftol |
5 g |
|
Alcohol absoluto |
100 g |
Solución 2
|
Ingredientes: |
|
|
Hidróxido de potasio |
40 g |
|
Agua destilada |
para llevar a 100 mL |
B.18.3.3.4.1 Prueba de Voges-Proskauer (VP).
1. Transferir 1 mL
del cultivo a probar con 48 horas de incubación a un tubo de ensaye.
2. Adicionar 0,6
mL de la solución 1 y 0,2 mL de la solución 2.
3. Agitar después
de la adición de cada solución.
4. Para
intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de
creatina y mezclar.
5. Dejar a
temperatura ambiente.
6. Leer resultados
después de 4 horas de adicionar los reactivos.
El desarrollo de
una coloración rosa es una prueba positiva.
B.18.3.3.4.2 Reactivos para la coloración de Gram
Cristal violeta
|
Solución A |
|
|
Cristal violeta
(colorante 90%) |
2 g |
|
Etanol 95% |
20 mL |
Solución B
|
Ingredientes: |
|
|
Oxalato de amonio |
0,8 g |
|
Agua destilada |
80 mL |
B.18.3.3.4.3 Indicador rojo de metilo (R44)
1. Mezclar la
solución A y B. Almacenar por 24 horas
2. Filtrar a
través de un papel filtro áspero.
B.18.3.3.4.4 lodo de Gram
|
Ingredientes: |
|
|
lodo |
1g |
|
Ioduro de potasio (Kl) |
2 g |
|
Agua destilada |
300 mL |
1. Colocar el Kl
en un mortero.
2. Adicionar el
yodo.
3. Triturar con el
pistilo por 5-10 segundos.
4. Adicionar 1 mL
de agua y triturar
5. Adicionar 5 mL
de agua y triturar
6. Adicionar 10 mL
de agua y triturar
7. Vaciar esta
solución en una botella de reactivo.
8. Enjuagar el
mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 300 mL.
B.18.3.3.4.5 Colorante de contraste (solución
concentrada)
|
Ingredientes: |
|
|
Safranina O |
2,5 g |
|
Etanol al 95% |
100 mL |
Solución de trabajo: Adicionar 10 mL de la solución concentrada a 90 mL de agua
destilada.
B.18.3.3.4.6 Procedimiento para la tinción de Gram:
1. Fijar con calor
moderado los frotis de la muestra a teñir.
2. Adicionar la
solución de cristal violeta al frotis.
3. Dejar actuar
por un minuto.
4. Lavar con agua
corriente y escurrir.
5. Aplicar la
solución de yodo por un minuto.
6. Lavar con agua
corriente y escurrir.
7. Decolorar con
etanol al 95% hasta que la coloración azul deje de fluir (aproximadamente 30
segundos).
8. Inmediatamente
después enjuagar con agua corriente
9. Escurrir.
10. Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 30 segundos.
11. Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio.
Medio EC-MUG
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurónido
(MUG) por litro antes de esterilizar (121°C por 15 minutos). El caldo EC-MUG
está comercialmente disponible.
B.18.3.3.4.7 Procedimiento
B.18.3.3.4.8 Agua y hielo
B.18.3.3.4.9 Prueba presuntiva
B.18.3.3.3.4.10 Agitar la muestra y transferir volúmenes de 10 mL a cada uno de 5
tubos con 20 mL de caldo lauril sulfato triptosa de doble concentración, 5
tubos con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL de caldo lauril sulfato triptosa de
concentración sencilla o las siguientes porciones: 10 tubos con 10 mL de muestra;
5 tubos con 20 mL de muestra o una porción de 100 mL; consultar la tabla del
inciso 2 en la preparación del "caldo lauril triptosa" para la
concentración de caldo lauril triptosa requerido. Los tubos deben contener una
campana de fermentación (Durham).
B.18.3.3.4.11 Incubar los tubos a 35 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 horas y
observar si hay formación de gas; si la formación de gas no se observa, incubar
24 horas más.
B.18.3.3.4.12 Prueba confirmativa
B.18.3.3.4.13 De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar
en un número igual de tubos con medio de confirmación, para la determinación de
bacterias coliformes referirse al método de Determinación de bacterias
coliformes. Técnica del Número más probable, para la determinación de bacterias
coliformes fecales, sembrar en caldo EC. Inocular a dos tubos con caldo EC una
cepa de E. coli como control positivo
y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e
incubar con las muestras.
B.18.3.3.4.14 Para la determinación de coliformes fecales incubar los tubos a 44,5
0,2°C en baño de agua con agitación durante 24 horas, observar si hay formación
de gas; si la formación de gas no se observa, continuar la incubación 24 horas
más, hacer la lectura. Utilizar estos resultados para calcular el número más
probable (NMP) de coliformes fecales.
B.18.3.3.5 Prueba confirmativa para Escherichia coli (por identificación bioquímica)
B.18.3.3.5.1 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos y
sembrar por estría cruzada en agar EMB-L para su aislamiento.
B.18.3.3.5.2 Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24
horas.
B.18.3.3.5.3 Seleccionar dos colonias de cada placa con la
siguiente morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin
brillo metálico y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas
de morfología microscópica y pruebas bioquímicas. Incubar las placas a 35°C por
18-24 horas.
B.18.3.3.5.4 Si no hay colonias con morfología típica, probar una
o más colonias lo más parecido E. coli
de cada placa.
B.18.3.3.5.5 Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al
microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.
B.18.3.3.6 Pruebas
Bioquímicas Indol, Rojo de metilo, Voges Proskauer, Citrato (IMViC).
a. Producción de
indol
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a
35°C por 24 2 horas. Adicionar 0,2-0,3 mL de reactivo de Kovacs. La presencia
de una coloración en la superficie del tubo se considera una prueba positiva.
b. Voges-Proskauer (VP)
Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35°C
por 48 2 horas. Transferir 1 mL a un tubo de 13X100 mm. Adicionar 0,6 mL de
solución de alfa naftol y 0,2 mL de hidróxido de potasio al 40% y agitar. Se
considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa.
c. Rojo de metilo
Inocular un tubo adicional con caldo MR-VP e incubar
a 35°C por 48 2 horas. Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo. Se
considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color
amarillo es una prueba negativa.
d. Citrato
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser un
inóculo ligero para evitar turbiedad en el tubo. Incubar a 35°C por 96 horas.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se
considera una prueba positiva.
e. Interpretación
de resultados
Todos los cultivos que: 1. Fermenten la lactosa con
producción de gas dentro de las 48 horas a 35°C; 2. Sean bacilos o cocobacilos
Gram negativos no esporulados y 3. Se obtenga las siguientes combinaciones para
el IMVIC:
Biotipo 1--, o Biotipo 2---, son consideradas como E. coli. Calcular el NMP de E. coli basada en la proporción de los
tubos positivos de caldo EC.
B.18.3.3.7 Prueba
Confirmativa para Escherichia coli (por el método de EC-MUG)
Fundamento.
Alrededor del 94% de las cepas de E. coli incluso las cepas no productoras
de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato
específico 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbelliferona
(MU), que al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga
(365 nm) produce una fluorescencia azul, fácil de observar. Cuando el MUG es
incorporado al caldo EC se puede identificar E. coli.
B.18.3.3.8 Seguir
lo indicado para Prueba Presuntiva
B.18.3.3.9 Prueba
Confirmativa
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una
asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación EC-MUG.
Inocular dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo. Incubar a estos tubos con uno adicional
de caldo EC-MUG sin inocular a 44,5 0,5°C en baño de agua con los tubos de las
muestras durante 24 horas, observar si hay formación de gas; si la formación de
gas no se observa continuar la incubación 24 horas más. Irradiar los tubos con
una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura. Utilizar estos
resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
B.18.3.3.10
Alimentos
B.18.3.3.10.1
Prueba Presuntiva.
B.18.3.3.10.2 Preparar la muestra como se indica en el método
Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológico; y
de acuerdo con el tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, según
se indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la técnica del
número más probable.
Utilizar como medio de enriquecimiento caldo lauril
triptosa y continuar como anteriormente
B.18.3.3.10.3
Prueba Confirmativa. Continuar como anteriormente
B.18.3.3.10.4 Prueba Confirmatoria.
Confirmar la
presencia de Escherichia coli en por
lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos a coliformes fecales
por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la
presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 0,5°C
durante 24 2 horas, observar las colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas
de un halo opaco de precipitación de sales biliares. Seleccionar 1 o más
colonias aisladas y pasar a tubos de fermentación con caldo lauril triptosa,
continuar como se indica anteriormente. Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las
colonias.
B.18.3.3.11 Interpretación de Resultados.
La formación de
gas en el tubo de fermentación secundario dentro de las 48 3 horas y la
demostración de bacilos Gram (-) no esporulados confirma un resultado positivo
de la prueba demostrándose la presencia del grupo coliforme.
B.18.3.3.12 Cálculos
Calcular la
densidad microbiana en número más probable conforme al procedimiento señalado
anteriormente, para estimar la población de bacterias coliformes y bacterias
coliformes fecales de acuerdo con las diluciones empleadas y expresar en NMP/g
o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volúmenes de 20
mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos,
utilizar las siguientes tablas:
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de
confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando
se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.
|
No. de Tubos |
|
95% de Límite de Confianza (aproximado) |
|
|
Positivos |
NMP/100 mL |
Inferior |
Superior |
|
0 |
1,1 |
0 |
3,0 |
|
1 |
1,1 |
0,05 |
6,3 |
|
2 |
2,6 |
0,3 |
9,6 |
|
3 |
4,6 |
0,8 |
14,7 |
|
4 |
8,0 |
1,7 |
26,4 |
|
5 |
8,0 |
4,0 |
Infinito |
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de límite de
confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando
se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.
|
No. de Tubos Positivos |
NMP/100 mL |
95% de Límite de Confianza (aproximado) |
|
|
Inferior |
Superior |
||
|
0 |
1,1 |
0,0 |
3,0 |
|
1 |
1,1 |
0,03 |
5,9 |
|
2 |
2,2 |
0,26 |
8,1 |
|
3 |
3,6 |
0,69 |
10,6 |
|
4 |
5,1 |
1,3 |
13,4 |
|
5 |
6,9 |
2,1 |
16,8 |
|
6 |
9,2 |
3,1 |
21,1 |
|
7 |
12,0 |
4,3 |
27,1 |
|
8 |
16,1 |
5,9 |
36,8 |
|
9 |
23,0 |
8,1 |
59,5 |
|
10 |
23,0 |
13,5 |
Infinito |
B.19
Determinación de Humedad en leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado,
sometidos a deshidratación.
B.19.1
Principio del Método.
Este método se basa en la pérdida de peso
debido a la evaporación del agua bajo condiciones establecidas.
B.19.2
Equipo.
B.19.2.1
Balanza analítica con sensibilidad de 0, 1 mg.
B.19.2.2 Estufa
eléctrica con regulador de temperatura a 100 102º C.
B.19.3
Materiales.
B.19.3.1
Desecador de vidrio con sílica gel con indicador de humedad u otro
desecante activo.
B.19.3.2
Cápsulas de vidrio, acero inoxidable, níquel o aluminio de 50 a 90 mm de
diámetro y de 12 a 25 mm de altura provistos de tapa que cierre herméticamente.
B.19.3.3
Pinzas metálicas especiales para las cápsulas.
B.19.4
Procedimiento.
B.19.4.1
Preparación de la Muestra.
B.19.4.1.1 Cuando
se tome la muestra operar tan rápido como sea posible. Evitar la absorción de
humedad del medio ambiente durante la preparación de la muestra. Mezclar el
producto transfiriéndolo a un frasco seco y bien tapado con capacidad
aproximada al doble del tamaño de la muestra. Mezclar cuidadosamente agitando e
invirtiendo repetidamente.
B.19.4.1.2 Sólo
para muestras que presentan grumos o terrones, tamizar la muestra a través de
una malla número 20 y si es necesario frotar el material a través de la malla y
golpear vigorosamente.
B.19.4.2
Preparación de las Cápsulas.
Secar las cápsulas destapadas en una estufa
controlada a 100-102ºC por una hora. Taparlas e introducirlas en un desecador y
dejarlas enfriar a temperatura ambiente. Pesarlas con una precisión de 0,1 mg.
B.19.4.3
Secado de las Muestras.
En las cápsulas previamente secadas y
pesadas, pesar con exactitud y distribuir homogéneamente de 1 a 3 g de muestra.
Secar en estufa (100-102ºC) durante 4 horas consecutivas, dejando las cápsulas
descubiertas, pero manteniendo las tapas correspondientes identificadas cerca
de ellas. Al término del periodo, cubrir las cápsulas con sus respectivas tapas
e introducirlas en el desecador. Enfriar a temperatura ambiente y pesar.
B.19.5
Cálculos.
En donde:
mo = masa en gramos
de la cápsula y la tapa.
m1 = masa en gramos
de la cápsula y tapa con la muestra antes de secar.
m2 = masa en gramos de la cápsula y la tapa con la
muestra después de secar.
B.19.6 Expresión de Resultados.
|
% Humedad |
B.20.
Determinación de Clostridium botulinum
y sus Toxinas en Alimentos y Muestras Clínicas
B.20.1
Fundamento
Demostrar la presencia de toxina botulínica
por inyección a ratones con extractos de alimentos o muestras clínicas y
observar el efecto letal. Comprobar con el antisuero específico la
neutralización de la toxina. La determinación de C botulinum se basa en el
cultivo de muestras de alimentos y clínicas en condiciones de anaerobiosis en
medios específicos y la subsecuente demostración de la toxina.
20.2 Toma y manejo de muestras
B.20.2.
Alimentos
Las muestras pueden tomarse de sobrantes de
los alimentos sospechosos o de recipientes cerrados. Cuando están involucrados
alimentos comerciales, es importante observar la etiqueta, número de lote del
fabricante, o cualquier dato relevante que pueda identificar el origen de la
muestra.
B.20.2.2 Clínicas
Las muestras clínicas para el análisis
incluyen: materia fecal, aproximadamente 10 g, contenido gástrico (ajustar
aproximadamente a pH 6 con hidróxido de sodio 0,1) y suero (colectado de 20 mL
de sangre ANTES DE ADMINISTRAR LA ANTITOXINA). Cuando se sospecha de botulismo
infantil es importante analizar las heces. Si fuera necesario, las manchas o
partes sólidas de los pañales.
B.20.3
Envío de muestras
B.20.3.1 Para
un envío seguro, el interior de los empaques deben contener:
(i) Un primer recipiente impermeable al
agua.
(ii) Un segundo recipiente impermeable al
agua.
(iii) Material absorbente (por ejemplo
unicel) entre los dos contenedores, suficiente para absorber el contenido
entero del primer recipiente.
B.20.3.2 De
preferencia enviar el material en refrigeración en paquetes que contengan
recipientes con gel congelado. Para una máxima preservación de la toxina el
recipiente secundario debe empacarse en una caja de unicel con recipientes de
gel congelado. Sin embargo, si se sospecha retraso en el envío, el material
debe congelarse y empacarse con hielo seco.
B.20.4
Materiales, Equipo y Reactivos
B.20.4.1 Flujo laminar
B.20.4.2 Propipeta o bulbo
B.20.4.3 Lentes de seguridad
B.20.4.4 Guantes de cirujano
B.20.4.5 Tubos de centrífuga de 40 mL de
capacidad
B.20.4.6 Centrífuga refrigerada con
capacidad de 15 000 x g
B.20.4.7 Jeringas desechables de 19 x 15.
B.20.4.8 Filtros desechables de 0,45ú m.
B.20.4.9 Vortex
B.20.4.10 Licuadora
B.20.4.11 Potenciómetro
B.20.4.12 Incubadora 30º, 35ºC
B.20.4.13 Balanza
B.20.4.14 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
B.20.4.15 Jeringas para tuberculina
B.20.4.16 Equipo para tinción de Gram
B.20.4.17 Ratones de preferencia hembras de
20 a 30 g cepa CFI o NIH
B.20.4.18 Antisuero trivalente ABE
B.20.4.19 Antisuero monovalente A,B,E y F
B.20.4.20 Tripsina al 1% p/v
B.20.4.21 Tripsina al 1,4%
B.20.4.22 Solución reguladora de fosfatos
con gelatina
B.20.4.23 Solución de tetraciclina al 0,2%
B.20.4.24 0,1 N NaOH o NaHCO3 saturado para
limpiar posibles derrames.
B.20.4.25 Tripsina al 1% p/v
B.20.4.26 Tripsina al 1,4%
B.20.4.27 Medio carne cocida (CMM)
B.20.4.28 Caldo tripticasa peptona glucosa
extracto de levadura (TPGY).
B.20.4.29 Caldo tripticasa peptona glucosa
extracto de levadura (TPGYT) con tripsina
B.20.4.30 Agar aislamiento Clostridium botulinum (CBI)
B.20.4.31 Agar hígado de ternera yema de
huevo
B.20.4.32 Agar esporulación de Eklund
B.20.4.33 Baño de agua (75-100ºC)
B.20.4.34 Etanol al 50% o absoluto
B.20.4.35 Jarras y sistema de anaerobiosis
B.20.5
Preparación de Medios de Cultivo
B.20.5.1 Medio de la Carne cocida (CMM).
FORMULA
Corazón de res 454 g
Proteosa peptona 20 g
Bactodextrosa 2 g
Cloruro de sodio 5 g
Extracto de corazón de res 1000 mL
Picar el corazón de res, sumergir en agua y
calentar hasta ebullición durante 1 h. Enfriar, ajustar el pH a 7,0, y hervir
10 minutos. Filtrar a través de muselina y presionar para drenar el exceso de
líquido de la carne. Guardar la carne cocida. Agregar los ingredientes al
filtrado y ajustar a pH 7,0, agregar agua hasta hacer 1000 mL. Filtrar a través
de papel filtro poroso. Se puede conservar el caldo y la carne en congelación
por separado. Agregar el corazón cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150
mm o 20 x 150 mm a una altura de 1,2 a 2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12
mL del caldo. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Si este medio se
almacena por más de 12 h después de su preparación, debe calentarse a ebullición
por 10 minutos y enfriar antes de su uso.
B.20.5.2 Caldo Tripticasa Peptona Glucosa Extracto
de Levadura (TPGY).
FORMULA
Tripticasa 50 g
Peptona 5 g
Glucosa 4 g
Extracto de levadura 20 g
Tioglicolato de sodio 1 g
Agua destilada 1000 mL
Disolver los ingredientes en agua caliente,
enfriar y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volúmenes de 21 mL en tubos de 20 x
150 mm con tapón de rosca. Esterilizar a 121±1ºC/15 min, enfriar a la
temperatura ambiente y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de
12 h, tratarlos con calor como se indica en B.19.9.1.
B.20.5.3 Caldo Tripticasa Peptona Glucosa Extracto
de Levadura adicionado con Tripsina (TPGYT).
FORMULA
Tripticasa 50 g
Peptona 5 g
Glucosa 4 g
Extracto de levadura 20 g
Tioglicolato de sodio 1 g
Agua destilada 1000 mL
Disolver los ingredientes en agua caliente,
enfriar y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volúmenes de 21 mL en tubos de 20 x
150 mm con tapón de rosca. Esterilizar a 121±1ºC/15 min, enfriar a la
temperatura ambiente, y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de
12 h tratarlo con calor como se indica en B.20.9.1. Agregar 1,5 mL de solución
de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 mL del medio TPGY. Mezclar muy
suavemente. Este medio no se puede almacenar.
B.20.5.4 Agar Hígado de Ternera Yema de huevo.
a) Agar
Hígado de ternera.
FORMULA
Infusión de hígado 50 g
Infusión de ternera 500 g
Proteosa peptona 20 g
Neopeptona 1,3 g
Triptona 1,3 g
Dextrosa 5,0 g
Almidón soluble 10,0 g
Caseína isoeléctrica 2,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Nitrato de sodio 2,0 g
Gelatina 20,0 g
Agar 15,0 g
Agua destilada 1000 mL
Calentar con agitación constante hasta
dilución completa. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC, pH final
7,3 ú 0,2.
Agregar por cada 500 mL del medio base fundido 40 mL de la suspensión salina de
yema de huevo. Mezclar y vaciar a cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm
(aproximadamente 15 20 mL). Secar las placas a temperatura del laboratorio
por 2 días o a 35ºC por 24 horas. Verificar esterilidad de las placas.
Almacenar en refrigeración.
b)
Emulsión al 50% de Yema de huevo.
Lavar los huevos con un cepillo suave y
dejar escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro mercúrico al
0,1%, escurrir. Sumergir en una solución de etanol al 70% y dejar durante 30
minutos, escurrir. Abrir los huevos en condiciones asépticas y descartar las
claras. Colocar las yemas en un recipiente estéril y mezclar con igual volumen
de solución salina fisiológica (0,85%) estéril. Guardar en refrigeración hasta
su uso.
B.20.5.5
Agar para Asilamiento de C. botulinum (CBI).
El agar CBI es una modificación del medio
agar McClung Toabe para el aislamiento selectivo y diferencial de C. botulinum,
el cual puede aislarse de los cultivos toxigénicos de CMM, provenientes de
muestras de heces, líquido gástrico o alimentos. El medio de agar CBI contiene:
Cicloserina 250 mg/ mL,
sulfametoxazol 76 mg/ mL y
trimetroprim 4 mg/ mL
en la base del medio agar McClung Toabe yema de huevo.
Agar McClung Toabe
FORMULA
Proteosa peptona 40 g
Bacto dextrosa 2 g
Fosfato de sodio dibásico 5 g
Fosfato de potasio monobásico 1 g
Cloruro de sodio 2 g
Sufato de magnesio 0,1 g
Agar 25 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7,6 +0,2 a 25ºC
Extracto de levadura 5 g
Suspensión de yema de huevo 100 mL
SOLUCION DE ANTIBIOTICOS
Cicloserina 250 mg o 25 mL de una solución
al 1,0%
Sufametoxasol 76 mg o 4 mL de una solución
al 1,9%
Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N
de NaOH.
Lactato de Trimetroprim 4 mg o 4 mL de una
solución al 0,1% por cada 100 mL de medio base
Esterilizar por filtración.
Preparación:
Agregar el extracto de levadura y los
ingredientes del agar McClug Toabe a un matraz de 2 L con 900 mL de agua
destilada, mezclar y calentar hasta disolución. Ajustar a pH 7,5. Esterilizar
15 minutos a 121ºC en autoclave. Enfriar a 55ºC en baño de agua y en
condiciones asépticas agregar 100 mL de la suspensión al 50% de yema de huevo.
Agregar los volúmenes necesarios para conservar la concentración de
antibióticos por litro de medio base. Mezclar y distribuir en cajas de Petri
estériles de 15 x 100 mm aproximadamente 15-20 mL por placa. Dejar solidificar
y colocar en bolsas de plástico. Guardar en refrigeración hasta su uso. Estas
placas pueden almacenarse hasta 1 mes aproximadamente.
B.20.5.6
Agar para Esporulación de Eklund.
FORMULA
Tripticasa 4 g
Peptona 1 g
Glucosa 0,1 g
Extracto de levadura 1 g
Agar 4 g
Agua destilada 200 mL
Disolver los ingredientes en agua caliente,
excepto el agar, ajustar a pH 7,8, agregar el agar. Esterilizar a 121±1ºC/15
min. y enfriar a 50ºC. Agregar 2 mL de solución al 10% de clorhidrato de
cisteína, esterilizada por filtración; 12 mL de emulsión de yema de huevo y 2
mL de sangre citratada de bovino o borrego. Preparar las placas. Este medio es
particularmente adecuado para la esporulación de C. botulinum del grupo
II.
B.20.6 Diluyentes y Reactivos
B.20.6.1 Solución Amortiguadora de Fosfatos con
Gelatina
FORMULA
Gelatina 2 g
Na2HPO4 4 g
Agua destilada 1000 mL
Ajustar a pH 6,2 con solución de ácido
clorhídrico 4N. Distribuir en frascos con tapón de rosca, esterilizar por
vapor, enfriar a la temperatura ambiente y almacenar a 4ºC.
B.20.6.2
Solución de Tetraciclina al 0,2%.
Disolver 50 mg en 25 mL del diluyente
fosfato de gelatina, mantener a 4ºC hasta 4 días. Si se requiere almacenar por
más tiempo, congelar en pequeñas porciones. Evitar la recongelación.
B.20.6.3
Solución de Tripsina (1:250).
a) Solución al 1%
Disolver 200 mg en 20 mL de agua destilada.
No almacenar.
b) Solución al 1,4%.
Disolver 280 mg en 20 mL del diluyente
fosfato de gelatina, filtrar a través de membrana de 0,45 ú m.
Usar vacío para obtener efecto parcial de deareación del filtrado.
B.20.6.4 Antisueros
A, B, E; A, B; A, B, E, C*, D*, F.
Investigación de sospecha de botulismo en
animales.
B.20.7
Procedimiento
B.20.7.1
Examen Microscópico de los Alimentos Sospechosos
Este examen no es esencial para la detección
de C. botulinum, pero facilita la selección de los alimentos sospechosos
para el análisis. Preparar frotis directos y hacer tinción de Gram. Si el
alimento contiene exceso de grasa, sumergir los portaobjetos fijados al calor
por 1-2 minutos en xilol antes de teñir.
B.20.7.2
Preparación del Material para el Análisis de las Toxinas.
B.20.7.2.1 Alimentos Líquidos:
Centrifugar aproximadamente 20 mL a 15000 x
g durante 20 minutos. Decantar cuidadosamente el sobrenadante o extraer con una
jeringa desechable de 19 x 25 mm. Cubrir el tubo y conservar a 4ºC para hacer
el cultivo del sedimento posteriormente. Repetir la centrifugación, si el
sobrenadante aún no está claro. Esterilizar el sobrenadante por filtración a
través de la membrana de 0,45 mm
adaptada a una jeringa desechable. Ocasionalmente puede requerirse una
prefiltración durante el proceso de filtración. El propósito de la
esterilización es prevenir una infección y a su vez una muerte inespecífica de
los ratones inoculados.
B.20.7.2.2
Alimentos Semilíquidos:
Colocar 10-15 g en tubos de centrífuga de 40
mL, agregar igual volumen de solución reguladora de fosfatos con gelatina y
homogenizar en vortex.
Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1.
B.20.7.2.3
Alimentos Sólidos:
Colocar 10-20 g en un vaso de licuadora o
mortero. Agregar suficiente solución reguladora de fosfatos con gelatina para
obtener cuando menos 10 mL de sobrenadante después de la centrifugación. La
dilución del alimento deberá estar entre 1:1 a 1:3. Licuar a velocidad alta por
1-2 minutos. Los vasos de licuadora deberán cerrarse herméticamente para
prevenir la formación de aerosoles. Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1,
B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3.
B.20.7.2.4
Alimentos Enlatados:
Lavar y secar la superficie de la lata.
Cubrir la tapa con etanol al 96%, dejar por 2 minutos; decantar y flamear el
alcohol residual. Colocar la lata en una bolsa de plástico para prevenir la
dispersión de aerosoles y abrir con un
abrelatas estéril. Proceder como en B.20.7.2.1, B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3.
B.20.7.2.5
Suero
Idealmente debe obtenerse 10 mL de suero. El
suero usado sirve sólo antes del tratamiento con el antisuero. Si está turbio,
centrifugar a 15,000 x g durante 20 minutos, decantar el sobrenadante.
B.20.7.2.6
Heces
Colocar 10 g en un tubo de centrífuga de 40
mL de capacidad, agregar suficiente cantidad de solución reguladora de fosfatos
con gelatina para obtener al menos 10 mL de sobrenadante después de la
centrifugación. Mezclar en vortex durante 2-3 minutos. Conservar la mezcla a
4ºC por 2 h. Homogeneizar en vortex. Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.7.La muestras líquidas, enemas
y el contenido intestinal se pueden centrifugar directamente con poco o sin la
adición de la solución reguladora de fosfatos con gelatina.
Ocasionalmente, los sobrenadantes de
muestras clínicas no se pueden filtrar, en estos casos, agregar 1 mL de una
solución al 0,2% de tetraciclina por cada 9 mL del sobrenadante.
B.20.7.2.8 Contenido Gástrico
Medir el pH y ajustar, si es necesario, a
5,5-6,5 con una solución 1N de NaOH. Evitar que el valor de pH sea mayor a 7,0.
Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1.
B.20.7.2.9
Otras Muestras Clínicas.
Tratar las muestras semilíquidas y sólidas
como en B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3
B.20.8 Análisis de las toxinas
B.20.8.1
Procedimiento General (se aplica cuando no se sospecha de alguna
toxina en particular).
B.20.8.1.1 Si se
dispone de suficiente material, distribuir el filtrado en volúmenes de 1,2 mL
dentro de 6 tubos de ensaye de 13 x 100 mm, marcados del 1-6. A los tubos
marcados 2-5, agregar 0,12 mL de los siguientes antisueros: monovalente A, B o
E y trivalente ABE. Mezclar en vortex y dejar reposar a temperatura ambiente
por 45 minutos.
B.20.8.1.2 Al
tubo 6, agregar 0,12 mL de una solución de tripsina al 1%. Incubar a 35ºC por
60 minutos. El tubo 1 no se adiciona. Ver tabla No. 2.
B.20.8.1.3 Si el
volumen de material es insuficiente para completar la prueba, se puede omitir
el tubo No. 6.
B.20.8.1.4
Inyectar dos ratones (20-30 g) intraperitonealmente por tubo, con los volúmenes
siguientes: 0,5 mL del tubo 1,0 y 0,55 mL de los tubos 2-6. Observar a los
ratones por 72 h. Los síntomas típicos de botulismo son: pelo erizado,
estrechamiento de cintura, dificultad para respirar, parálisis de los miembros
posteriores y parálisis general antes de la muerte. Si estos síntomas se
presentan después de 72 h, observar a los animales por otras 24 h hasta
completar un total de 4 días.
B.20.8.1.5 Si
mueren 1 o 2 ratones repetir la inyección. Una muestra se considera positiva
para la toxina si 2/2 o > o = 2/4 ratones mueren, si se presenta la muerte
de los animales dentro de las 2 primeras horas se pueden considerar que son
debidas a otras causas diferentes a toxina botulínica.
B.20.8.1.6 Si
solamente mueren los ratones inoculados con las muestras tratadas con tripsina,
indica la presencia de toxina de grupo II y continuar como se indica en el
punto B.20.8.3.
B.20.8.1.7 Si no
se neutralizara la toxina con los antisueros A, B y E, indica
a) la
presencia de toxinas no relacionadas en especial cuando se presentan síntomas
atípicos;
b)
Cantidad insuficiente de antisuero en presencia de altos niveles de toxina
(difícil en caso de muestras clínicas y en la mayoría de los alimentos tóxicos;
o
c)
incluido un serotipo no común. Si la muestra probada produce síntomas típicos
de botulismo y sin embargo no es neutralizada con los antisueros, proceder de
la forma siguiente:
i) En
casos de muy alta toxicidad, diluir la muestra 1:10 con solución amortiguadora
de fosfatos gelatina y repetir la prueba de neutralización.
ii)
Incluir el antisuero F en la prueba de neutralización.
B.20.8.2 Muestras Sospechosas de contener Toxina
Grupo V (A o B).
Proceder como se indica anteriormente
omitiendo el tubo No. 6.
B.20.8.3
Muestras Sospechosas de contener Toxina Grupo II (B o E).
Distribuir
en cada uno de los tubos marcados del 1 al 4, 1,2 mL del filtrado. A cada tubo
agregar 0,12 mL de una solución de tripsina al 1%, incubar a 35ºC por 60
minutos. A los tubos marcados del 2 al 4 agregar 0,12 mL de uno de los
siguientes antisueros monovalente B o E y trivalente A, B y E. Mezclar y
continuar como se indica anteriormente Inyectar
0,5 mL del tubo No. 1 y 0,6 mL de los tubos 2 al 4.
Si no
hubiese material disponible suficiente, omitir los tubos con los antisueros
monovalentes B y E.
B.20.8.4 Determinación de la Dosis Letal en
ratón (DLR)
Si se
quiere titular la toxina, hacer diluciones decimales de los sobrenadantes
tratados, y no tratados con tripsina, generalmente se hacen hasta 1:1000 dependiendo
del nivel de toxina esperado, pero nunca excediendo 1:10000. Inyectar 2 ratones
por dilución. La recíproca de la dilución más alta que causa la muerte
multiplicada por 2, es la DLR. Ejemplo: si la muerte ocurre a una dilución de
1:100 pero no de 1:1000, el nivel de toxina es de 200 a 2000 DLR por mL.
B.20.9 Identificación de Clostridium botulinum.
B.20.9.1 Quitar el exceso
de aire disuelto en los tubos preparados con medio caldo carne cocida (CMM) y
caldo glucosa peptona tripticasa extracto de levadura (TPGY), mediante
calentamiento en baño de agua a ebullición por 10 minutos y enfriar antes de
usarlos. Asegurarse de que las tapas de los tubos estén flojas al hacer este
proceso.
B.20.9.2 Agregar a los
tubos de TPGY 1,5 mL de una solución de tripsina al 1,4% y mezclar suavemente y
marcar con una T (TPGYT). A los tubos de CMM marcarlos con 1 y 2; y 3 y 4 a los
tubos con TPGYT. Ver tabla No. 3.
B.20.9.3 Cualquier tipo de
muestra incluyendo los sedimentos, pueden servir como inóculo; éstos además
tienen la ventaja de que no contienen inhibidores potenciales, los cuales se
han eliminado junto con el sobrenadante, de aquí que los sedimentos pueden
contener grandes cantidades de microorganismos por unidad de volumen.
B.20.9.4 Colocar
aproximadamente 1 g de inóculo a cada uno de los tubos 1 a 3, calentar el tubo
No. 2 en baño de agua a 75ºC por 20 minutos para seleccionar esporas
resistentes al calor.
B.20.9.5 Para seleccionar
esporas sensibles o resistentes al calor, suspender aproximadamente 1 g del
inóculo en un volumen de 10 a 20 mL de solución de etanol al 50%, o mezclar el
inóculo, cuando la muestra es líquida 1:1 con etanol absoluto o de 96%.
Mantener las suspensiones o mezclas a temperatura ambiente por 60 minutos,
centrifugar a 14000 x g durante 15 minutos, y pasar el sedimento al tubo No. 4.
B.20.9.6 Incubar los tubos
a 35ºC por 24 horas y a 30ºC por 4 días. Centrifugar aproximadamente 10 mL de
cultivo a 15000 x g durante 20 minutos. Esterilizar el sobrenadante por
filtración a través de membranas de 0,45 m m, con ayuda de una jeringa desechable. Diluir el
filtrado 1:5 con solución amortiguadora de fosfatos con gelatina. Continuar
como se indica en B.20.6.1 para el ensayo de toxina pero omitiendo el tubo No.
6.
B.20.9.7 Si fuera
necesario neutralizar con antisuero tipo F, el cual es relativamente débil,
determinar la toxicidad y diluir con solución amortiguadora de fosfatos de
gelatina el sobrenadante a aproximadamente 10 DLR/mL. Mezclar volúmenes de 1,25
mL con 0,25 mL de antisuero F. Inyectar 0,5 mL sin antisuero y 0,6 mL con
antisuero.
B.20.10 Aislamiento de Clostridium botulinum a
partir de Cultivos Toxigénicos.
B.20.10.1 El aislamiento de
cepas productoras de botulismo, se facilita si se dan todas las condiciones
para la producción de toxina. Si los cultivos de los tubos Nos. 2 o 4 son
toxigénicos, uno de éstos debe seleccionarse. Sembrar directamente en agar
hígado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamiento de Clostridium botulinum (CBI), en estos medios no se ha observado un enmascaramiento
por microflora atípica. En el caso de que predominara flora atípica combinada
con la presencia de algunas esporas de C.
botulinum, el inóculo debe hacerse
previo tratamiento con etanol. En el caso de ausencia de esporas, reincubar los
tubos de enriquecimiento o pasar al medio de esporulación (Eklund).
B.20.10.2 Aislamiento de C. botulinum
de Cultivos con Presencia Moderada de Microorganismos Atípicos.
B.20.10.2.1 Hacer una tinción
de Gram de los cultivos tóxicos. Si los cultivos 2 y 4 son tóxicos, pueden
excluirse los tubos 1 y 3. Seleccionar los cultivos sobre las siguientes bases:
i)
Bacilos gram positivos atípicos.
ii)
Número de bacilos gram positivos con esporas. Si en la tinción se observa un
mínimo de 10% de bacilos gram positivos, inocular una asada en agar hígado de
ternera-yema de huevo y en agar CBI. Incubar en anaerobiosis a 30ºC por 48
horas.
NOTA:
Es importante tomar en cuenta que cultivos viejos de C. botulinum pueden
aparecer como Gram negativos.
B.20.10.2.2 Seleccionar 5
colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que
presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY.
Seleccionar otras 5 colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum
rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a
30ºC durante 5 días. Hacer pruebas para determinar las toxinas como se indica
en B.4.6, inocular por duplicado los cultivos toxigénicos en agar hígado de
ternera yema de huevo, incubar una placa en anaerobiosis y otra en aerobiosis
para asegurar pureza. Nota: Es necesario inocular un gran número de colonias,
debido a que C. botulinum puede enmascararse por otros clostridia que presentan
características coloniales similares.
B.20.10.3
Aislamiento de C. botulinum de Cultivos con Grandes
Cantidades de Microorganismos Atípicos.
B.20.10.3.1 Si en
la tinción de Gram se observan bacilos gram positivos con esporas, mezclar 2 mL
del cultivo, con 2 mL de etanol al 96%, y dejar a temperatura ambiente por 60
minutos. Inocular una asada en agar hígado de ternera yema de huevo y en agar
aislamiento de C. botulinum, y continuar como se indica en B.20.10.1
B.20.10.3.2 Si no
se presenta esporulación en el medio de enriquecimiento, reincubar por otra
semana a 30ºC o extender 0,1 mL del cultivo en agar de esporulación de Eklund,
e incubar las placas en anaerobiosis a 30ºC hasta que las esporas estén
presentes en cantidades significativas (generalmente se requieren de 5 a 10
días. Suspender una asada del cultivo en aproximadamente 2 mL de etanol al 50%,
dejar a temperatura ambiente por 60 minutos, e inocular en agar hígado de
ternera yema de huevo y en agar CBI. Continuar como se indica en B.20.10.1.
TABLA No. 1
ALGUNAS CARACTERISTICAS DE C. BOTULINUM GRUPOS I Y II
|
GRUPO CRECIMIENTO POR
ABAJO DE 10ºC |
TEMPERATURA PARA
CRECIMIENTO Y PRODUCCION DE TOXINA |
|
|
|
|
|
I |
A,B,
Fb |
+ |
+ |
- |
30 - 37ºC |
|
II |
Bc,E,F b |
+ |
- |
+ |
26 - 30ºC |
*
Algunas cepas de los tipos A y B pueden presentar subtipos A-B, A-F. B-A. B-F,
cada una produce una toxina en mayor cantidad (representada por la primera
letra del subtipo).
b No
común
c No
común en Norteamérica
TABLA No. 2 PRUEBA
DE NEUTRALIZACION Y TOXICIDAD EN RATON
|
TUBO No. |
Volumen de muestra (mL) |
Antisuero |
Volumen del Antisuero (
mL) |
Volumen iunoculado ( mL) |
|
1 |
1,2 |
- |
- |
0,5 |
|
2 |
1,2 |
AntiA |
0,12 |
0,55 |
|
3 |
1,2 |
AntiB |
0,12 |
0,55 |
|
4 |
1,2 |
AntiE |
0,12 |
0,55 |
|
5 |
1,2 |
Anti A,B,E |
0,12 |
0,55 |
|
6 |
1,2 |
Tripsina |
0,12 |
0,55 |
TABLA No 3 ENRIQUECIMIENTO
|
TUBO No. |
MEDIO |
TRATAMIENTO |
|
1 |
CMM |
NINGUNO |
|
2 |
CMM |
CALOR |
|
3 |
TPGYT |
NINGUNO |
|
4 |
TPGYT |
ALCOHOL |
B.21.
Determinación de Acidez en Cremas y Productos Lácteos Fermentados y
Acidificados
B.21.1 Principio del Método.
La acidez se mide con base a una titulación
alcalimétrica con NaOH 0.1 N utilizando fenolftaleína como indicador.
B.21.2 Equipo.
B.21.2.1
Potenciómetro (opcional)
B.21.2.2
Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg.
B.21.2.3
Agitador magnético
B.21.3
Materiales.
B.21.3.1 Probeta graduada de 100 mL.
B.21.3.2 Pipeta volumétrica de 9 mL
(estándar para crema).
B.21.3.3 Matraz Erlenmeyer de 125 mL
B.21.3.4 Bureta de 25 o 50 mL graduada en
0.1 mL.
B.21.3.5 Barra magnética (opcional).
B.21.4 Reactivos.
Todos los reactivos deben ser grado
analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se entiende
agua destilada recientemente hervida.
B.21.4.1
Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 N valorada.
B.21.4.2
Solución indicadora de fenolftaleína (C29H14O4) al
1%.
B.21.5
Procedimiento.
B.21.5.1 Medir
9 mL (si se emplea la pipeta estándar de crema) o pesar 18 g de muestra
perfectamente mezclada en un matraz Erlenmeyer o una cápsula de porcelana. Si
la muestra es medida volumétricamente, enjuagar la pipeta con veces su volumen
de agua y adicionar los enjuagues al matraz o cápsula y mezclar bien.
B.21.5.2
Si la muestra es pesada, añadir 2 veces el peso de la misma en agua y
mezclar bien.
B.21.5.3
Adicionar 0.5 mL de indicador de fenolftaleína y titular con solución de
hidróxido de sodio 0.1 N hasta la aparición de un color rosa permanente por lo
menos 30 segundos (se recomienda emplear siempre una cantidad constante de
indicador ya que su concentración puede influir en los resultados).
B.21.5.4 Si la
muestra es obscura o colorida, será necesario después de agregar agua, titular
con ayuda de un potenciómetro a un pH de 8.3.
B.21.5.
Cálculos
%Acidez(expresada como ácido
láctico) = (VxNx9)/M
donde:
V = mL de NaOH 0.1 N gastados en la
titulación.
N = Normalidad de la solución de NaOH
M = Volumen o peso de la muestra.
B.21.7
Expresión de resultados.
|
% Acidez titulable expresada como ácido láctico |
B.22.
Determinación de Vitamina A por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC en fase
reversa).
B.22.1
Principio del método.
Los lípidos son ésteres que en presencia de
un álcali cáustico se hidrolizan liberando el material insaponificable, el cual
es extraído con un disolvente orgánico. Posteriormente la vitamina A contenida
en este material, es cuantificada por medio de Cromatografía de Líquidos de
Alta Resolución.
B.22.2
Equipo.
B.22.2.1. Sistema de HPLC que incluye:
B.22.2.1.1 Bomba binaria LC. ( se puede
contar con una trinaria o cuaternaria)
B.22.2.1.2 Inyector automático o manual de
muestras.
B.22.2.1.3 Detector espectrofotométrico de
longitud de onda variable UV-Visible LC.
B.22.2.1.4 Integrador computarizado LC.
B.22.2.1.5 Columna Octadecil ODS (20),
tamaño de partícula 5, longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm.
B.22.2.1.6 Balanza analítica, con capacidad
de 160 g, lectura 0,1 mg.
B.22.2.1.7 Placas de agitación con
calentamiento.
B.22.2.1.8 Cilindro para gas comprimido de nitrógeno pureza 95%.
B.22.2.1.9 Cilindro
para gas comprimido de helio pureza 95%.
B.22.2.1.10 Evaporador
rotatorio con elevador rápido y baño maría.
B.22.2.1.11 Equipo de filtración para la
preparación de la fase móvil.
B.22.2.1.12 Cronómetro o reloj.
B.22.3
Materiales.
B.22.3.1 Matraces volumétricos actínicos o
de color marrón con tapón de vidrio o teflón de 50 y 100 mL.
B.22.3.2 Matraces actínicos o de color
marrón de fondo plano, cuello corto de 250 mL.
B.22.3.3 Matraces, en forma de pera
actínicos o de color marrón, de cuello corto y boca esmerilada de 500 mL (que
embone en el rotavapor). Si no se contaran con estos, se pueden utilizar
matraces de fondo plano.
B.22.3.4 Matraces volumétricos actínicos o
de color marrón de 10 mL.
B.22.3.5 Vasos de precipitados de 500 mL.
B.22.3.6 Embudo de separación cónico,
actínicos o de color marrón, con llave de teflón 500 mL.
B.22.3.7 Embudo tallo corto diámetro 12 cm.
B.22.3.8 Tapones de teflón huecos
hexagonales o actínicos o de color marrón.
B.22.3.9 Refrigerante con macho y hembra,
manguito 300 mL, de 50 cm de longitud aproximadamente.
B.22.3.10 Manguera de látex.
B.22.3.11 Papel filtro mediano No. 1 con
diámetro de 18,5 cm., O también se podrán utilizar diámetros de 11 y 12.5 cm
B.22.3.12 Pipetas volumétricas con marca de
5 y 4 mL.
B.22.3.13 Jeringa de vidrio sin aguja
desechable de 10 mL. Se pueden utilizar jeringas plásticas sin aguja
desechables de 10 mL.
B.22.3.14 Filtros para jeringa (acrodiscos
para HPLC) de 0,45 mm de
tamaño de poro y diámetro de 25 mm, para solventes orgánicos y fase móvil.
B.22.3.15 Membranas de filtración de
fluoruro de polivinilideno, utilizada para fases móviles (solventes orgánicos y
acuosos), cuyos extractables sean de absorción en UV, u otro filtro para fines
similares.
B.22.3.16 Magnetos para placa de agitación.
B.22.4
Reactivos.
B.22.4.1 Los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico y por agua debe entenderse agua destilada.
B.22.4.2 Estándar de retinol (vitamina A)
cristalizada (C20H30O) all trans
RETINOL con certificado de pureza.
B.22.4.3 Hidróxido de potasio en lentejas
(KOH).
B.22.4.4 Alcohol etílico absoluto (C2H5OH).
B.22.4.5 Eter de petróleo intervalo de
ebullición 40 - 60°C.
B.22.4.6 Fenolftaleína en solución etanólica
al 1%, indicador ( C20H14O4).
B.22.4.7 Metanol grado HPLC (CH3OH).
B.22.4.8 Agua destilada filtrada, grado HPLC
(sólo para la preparación de fase móvil).
B.22.4.9 Agua destilada que se utilizará en
los lavados del saponificado (verificar que el valor de pH no sea mayor de
6,0).
B.22.4.10 Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).
B.22.4.11 Acido ascórbico (C6H8O6).
B.22.4.12 Fase móvil metanol: agua (95:5)
para HPLC.
Pasar agua destilada a través de una
membrana de filtración para soluciones acuosas. Pasar metanol a través de una
membrana de filtración para solventes orgánicos. Posteriormente mezclar 50 mL
de agua destilada en 950 mL de metanol (fase móvil). Degasificar la fase móvil
pasando una ligera corriente de gas helio o por ultrasonido 15 minutos a
temperatura ambiente. Si el equipo cuenta con desgasificador integrado, permitir
que la mezcla la realice el mismo.
B.22.4.12
Soluciones Patrón de Vitamina A. Siempre y cuando se garantice la estabilidad
de la misma, a través de un controlado
en un Gráfico de Factor de Respuesta.
B.22.4.12.1
Solución Concentrada (150 mg
equivalentes de retinol).
Justo antes de emplearse, pesar 15 mg de
retinol cristalizado (A - OH) y registrar el peso exacto. Colocar el estándar
pesado en un matraz volumétrico de 100 mL. Disolver con metanol y llevar al
volumen.
B.22.4.12.2
Solución Intermedia (15 mg
equivalentes de retinol).
Diluir 5 mL de la solución concentrada a 50
mL con el mismo metanol para obtener una solución de aproximadamente 50 UI/mL.
B.22.4.12.3
Solución de Trabajo (6 mg
equivalentes de retinol).
Añadir 4 mL de la solución estándar intermedia
al matraz marcado como estándar y adicionar los reactivos al igual que al
blanco y muestra como se indica en el apartado de saponificación. Esta solución
tendrá aproximadamente 20 UI/mL de vitamina A, al final del proceso de
recuperación, en el matraz volumétrico de
10 mL.
Nota 1: Si el
certificado de % de pureza en el estándar es inferior al 85% no debe prepararse
la solución patrón, siendo necesario un nuevo estándar de otro lote con una
pureza superior a la antes indicada.
Nota 2: La
vitamina A-OH (A-alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz.
Al abrir una ampolleta nueva de vitamina A-cristalizada, pesar la cantidad de
estándar requerida y guardar la ampolleta bajo atmósfera de nitrógeno o en
condiciones similares.
B.22.5
Procedimiento
Nota 3: La
vitamina A es sensible a la luz. Utilizar material actínico o de color marrón o
bien, proteger el material con papel aluminio. Por otra parte, efectuar las
evaporaciones con rotavapor a una temperatura máxima de 40ºC. Evaporar a
sequedad y romper el vacío e inmediatamente introducir nitrógeno al sistema o
al matraz, para evaporar los últimos mililitros mediante una corriente de
nitrógeno.
B.22.5.1
Toma de Muestra.
En el caso de productos deshidratados,
reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas en la
etiqueta o 130 g del producto llevados a 1 L con agua. Disolver y agitar la
muestra a fin de homogeneizarla por completo.
Medir de preferencia por duplicado una
cantidad de muestra tal, que contenga de 30 a 90 mg equivalentes de retinol (100 a 300 UI de vitamina
A) o la cantidad correspondiente a lo declarado en la etiqueta de la muestra.
En caso de no contar con esta información no es conveniente realizar el
análisis.
B.22.5.2
Saponificación.
B.22.5.2.1 Marcar
4 matraces actínicos de cuello corto y esmerilado con fondo plano de 250 mL
(cuando la muestra se trabaje por duplicado) de la siguiente manera: blanco,
estándar y muestra.
B.22.5.2.2 Añadir
los siguientes reactivos a cada uno de los matraces antes mencionados: 7 g de
hidróxido de potasio y a continuación añadir 60 mL de alcohol absoluto. Mezclar
para disolver. Agregar 0,5 g de ácido ascórbico así como una barra magnética.
Adicionar una ligera corriente de nitrógeno a cada uno de los matraces.
B.22.5.2.3 Montar
un sistema de reflujo y calentar durante 30 minutos en placas de calentamiento
o baño de agua en ebullición con agitación constante.
Nota 4:
Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.
B.22.5.3 Extracción del Insaponificable.
B.22.5.3.1
Una vez concluido el tiempo de saponificación, enjuagar con máximo 30 mL
de agua destilada (evitar el exceso de agua para prevenir la formación de
emulsiones) por las paredes internas del refrigerante sin quitar el matraz del
saponificado. Enfriar el matraz aun instalado al refrigerante sumergiéndolo
parcialmente en un vaso de precipitados que contenga agua fría, lo anterior con
la finalidad de llevarlo a temperatura ambiente, evitando enfriarlo demasiado.
Trasvasar la suspensión a un embudo de separación de 500 mL.
B.22.5.3.2
Enseguida enjuagar el matraz con 100 mL de éter de petróleo que se
añaden al embudo de separación. Extraer la vitamina A agitando ligeramente.
Dejar separar las fases. Vaciar la fase acuosa a otro embudo de 500 mL. Recoger
la fase orgánica a un tercer embudo de separación de 500 mL. Repetir la
operación dos veces más, enjuagando el matraz con dos porciones de 100 mL de
éter cada una.
B.22.5.3.3
Efectuar esta extracción 3 veces en total (un lavado de 50 mL y 2
lavados de 100 mL). Hacer las agitaciones con mucho cuidado para evitar
emulsiones.
B.22.5.3.4
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 mL de agua adicionándola
por las paredes del embudo, agitando suavemente, hasta que el agua del lavado
ya no dé reacción colorida con la fenolftaleína. Después del último lavado,
esperar de 15 a 30 minutos antes de vaciar la fase acuosa y volver a revisar
con el indicador que no exista reacción colorida.
B.22.5.3.5
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene
aproximadamente 10 g de sulfato de sodio anhidro y recoger el filtrado en un
matraz de pera de 500 mL, sin dejar secar el filtro. Al final enjuagar el
sulfato de sodio contenido en el filtro con 50 mL de éter de petróleo.
B.22.5.3.6
Evaporar el disolvente en un rotavapor a 40ºC y dejar un remanente de
aproximadamente 6 mL. Tratar de reducir esta cantidad del disolvente a un
volumen de 2 mL aproximadamente mediante una corriente de nitrógeno.
B.22.5.3.7
Disolver el remanente obtenido con 3 mL de la fase móvil y recolectar
cuantitativamente la solución con una jeringa de vidrio. Filtrar la solución a
través de un filtro acrodisco de 0,45 µm
a un matraz actínico de 10 mL. Lavar el matraz pera con porciones de 2 mL de
fase móvil y repetir el mismo procedimiento hasta llegar al aforo del matraz.
Hacer lo mismo para cada filtro de blanco, estándar y probar por duplicado.
Nota 5: Se
recomienda acondicionar el acrodisco de 0,45 mm con metanol antes de utilizarlo en la filtración
del recuperado.
B.22.5.4
Condiciones Cromatográficas.
B.22.5.4.1 Fijar
los siguientes parámetros de acuerdo con las instrucciones de operación del
cromatógrafo.
Columna Octadecil ODS (20), tamaño de
partícula 5 mm,
longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm.
Loop de inyección: 20 mL.
Fase móvil: metanol: agua 95:5.
Flujo: 1 mL/min.
Detector: Longitud de onda ajustada a 325
nm.
Registrador: 5 mm/min.
B.22.5.5 Determinación de Vitamina A.
Inyectar dos veces los siguientes analitos:
primero 20 mL del
blanco, después 20 mL de la
solución estándar para HPLC (20 UI/mL aprox.) y por último 20 mL de la muestra
(del saponificado).
B.22.5.5.1
En el cromatograma, identificar el pico y tiempo de retención de la
vitamina A correspondiente al estándar. Con estos datos, identificar el pico y
tiempo de retención de la vitamina A contenida en la muestra.
B.22.5.5.2
Calcular el área o la altura del pico de la solución patrón y de las
muestras en los cromatogramas obtenidos.
B.22.6
Cálculos.
El contenido de vitamina A, expresado en
Unidades Internacionales por L de producto es igual a:
En donde:
m = toma de ensayo en g o mL.
hP = altura del pico de la
muestra, en mm.
hS = altura del pico de la
solución estándar final, en mm.
C = concentración de la solución estándar
final inyectada, en UI/mL para la vitamina A.
V = volumen de solución estándar final, en
el cual ha sido diluido el remanente antes de la cromatografía.
Los resultados deben reportarse como mg equivalentes de
retinol.
B.22.7
Expresión de Resultados.
|
mg
equivalentes de retinol/ L 1 UI = 0,3 mg equivalentes
de retinol (todos los retinoles trans) |
B.23
Determinación de Vitamina D3 HPLC
B.23.1
Fundamento
Saponificación alcalina de la muestra;
extracción con éter de compuestos insaponificables; evaporación del éter;
solución del residuo seco en hexano e inyección de una alícuota en columna
preparativa de HPLC (fase normal, Sílice). Colección del eluato que contiene la
fracción de vitamina D; evaporación de esta fracción a sequedad, disolución en
la fase móvil de HPLC (Analítica, Acetonitrilo: Cloruro de metileno:
Isopropanol), inyección en HPLC (fase reversa C18) y determinación de la
vitamina D con el pico máximo a 264 nm por calibración del estándar externo.
B.23.2
Preparación de la muestra.
En el caso de productos deshidratados
reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas en la
etiqueta o 130 g de producto llevado a 1 L con agua. Disolver y agitar la
muestra a fin de homogeneizarla por completo. Medir de preferencia por
duplicado una cantidad de muestra que contenga de 0,5 a 1 úg de
vitamina D3 (20 a
40 UI).
B.23.3 Material
B.23.3.1 Instalación HPLC isocrática
B.23.3.2 Uno o dos registradores
B.23.3.3 Balanza analítica, con capacidad de
160 g, lectura 0,1 mg
B.23.3.4 Balanza de precisión, con capacidad
de 1600 g, lectura 0,01 g
B.23.3.5 Estufa de laboratorio (para
productos con almidón)
B.23.3.6 Baño de agua con agitadores
magnéticos, 4 plazas
B.23.3.7 Evaporador rotatorio con elevador
rápido y baño
B.23.3.8 Matraces aforados, vidrio marrón,
tapón de vidrio de 5, 50 y 100 mL
B.23.3.9 Matraz de fondo plano, cuello
corto, vidrio marrón de 250 mL
B.23.3.10 Matraces, en forma de pera, vidrio
marrón de 10 y 500 mL
B.23.3.11 Embudo de separación cónico,
vidrio marrón, con llave de 500 mL
B.23.3.12 Embudo, vidrio marrón, diámetro 12
cm
B.23.3.13 Tapones huecos hexagonales, vidrio
marrón
B.23.3.14 Refrigerante con macho y hembra,
manguito 300 mm
B.23.3.15 Alargadera para introducción de
gas
B.23.3.16 Filtro plisado mediano con
diámetro de 18,5 cm
B.23.3.17 Pipeta aforada, con una marca de 2
mL
B.23.3.18 Jeringuillas de 1 y 5 mL
B.23.3.19 Aguja para jeringuillas
B.23.3.20 Cilindro
para gas comprimido, nitrógeno
B.23.3.21 Monodetentor
para gas comprimido, N2
B.23.3.22 Filtro de
0,45 µ de diámetro
B.23.3.23 2 Columnas
de 5 µ, 4,6 X 250
B.23.3.24 Aparato de
filtración
B.23.3.25 Filtro 0,5 µ
B.23.4 Reactivos
B.23.4.1
Colecalciferol, vitamina D3, cristalizada para fines bioquímicos (C27H44O)
B.23.4.2 Hidróxido
de potasio en lentejas para análisis (KOH)
B.23.4.3 Alcohol
etílico absoluto, para análisis (C2H5OH)
B.23.4.4
Hidroquinona (C6H4(OH)2)
B.23.4.5 Eter de
petróleo para análisis intervalo de ebullición 40 -60°C
B.23.4.6
Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador (C6H4OH)2COC6H4CO)
B.23.4.7 Diastasa
(para productos de almidón)
B.23.4.7 2-propanol
(CH3)2CHOH
B.23.4.8 n-hexano
CH3(CH2)4CH3
B.23.4.9
Acetonitrilo (CH3CN)
B.23.4.10
Diclorometano (CH2Cl12)
B.23.4.11 Sulfato de
sodio anhídro para análisis (Na2SO4)
B.23.4.12 Nitrógeno
(N2)
B.23.4.13 Acido ascórbico (C6H8O6)
B.23.4.14
Fase Móvil para HPLC Preparativa, 2-propanol al 1% en n-hexano
Degasificar el n-hexano bajo presión
reducida y pasar a través un filtro. Mezclar 100 mL de diclorometano con 900 mL
de acetonitrilo degasificado.
B.23.4.15 Fase Móvil Analítica, diclorometano:
acetonitriloisopropano (10: 89: 1) para HPLC analítica
Degasificar 1 l de acetonitrilo bajo presión
reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 100 mL de diclorometano con 890
mL de acetonitrilo degasificado y 10 mL de 2-propanol.
Nota: La
proporción diclorometano/acetonitrilo debe adaptarse de modo que la vitamina D3
dé un tiempo de retención de aproximadamente 8-9 min. Sin embargo no debería
rebasar 20:100.
B.23.4.16 Fase Móvil para lavar la Columna
Preparativa, 2-propanol al 10% en n-hexano
Mezclar 100 mL de 2-propanol con 900 mL de
n-hexano degasificado.
B.23.4.17 Solución Patrón de Vitamina D3 para HPLC
preparativa
En un matraz aforado de 100 mL, pesar
exactamente 50,0 mg de colecalciferol (D3) cristalizado, disolver en n-hexano y
llevar al volumen con el mismo disolvente (= solución de 20,000 U.I./ mL).
Diluir esta solución 1000 veces con el mismo
disolvente para obtener una solución de 20 U.I./ mL . Esta solución permanece
estable de 3 a 4 semanas a +4°C.
B.23.4.18 Solución Patrón de Vitamina D3 para HPLC Analítica
Evaporar 2 mL de solución patrón de 20 U.I./
mL (B.20.4.4) y tomar el residuo en 2 mL de fase móvil (B.20.4.2).
B.23.5 Procedimiento
Notas: La
vitamina D3 es sensible a la luz. Utilizar material de vidrio marrón o proteger
el material corriente con papel aluminio.
Efectuar todas las evaporaciones de
disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 40°C. No se debe
evaporar a sequedad. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema.
Evaporar los últimos mL mediante una corriente de nitrógeno.
Al final de la jornada, lavar la columna
preparativa durante 15 min con 2-propanol al 10% en n-hexano (B.20.4.3) con un
caudal de 2 mL /min.
B.23.5.1 Toma de Ensayo
Mezclar o moler la muestra a fin de
homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una toma de
ensayo que contenga 20-40 U.I. de vitamina D3.
B.23.5.1.1 Productos con Almidón:
En un matraz redondo de fondo plano de 250
mL con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 10% de su peso de
diastasa. Añadir máximo 30 mL de agua destilada a 45-50°C. Mezclar bien para
obtener una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante
nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 30 min en una estufa a 45°C.
B.23.5.1.2 Productos sin Almidón:
En un matraz redondo de fondo plano de 250
mL con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con máximo 30 mL de agua
destilada a 45-50°C.
B.23.5.2
Saponificación
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado
analítico en el matraz (B.23.5.1.1 o B.23.5.1.2), y mezclar para disolver.
A continuación añadir 60 mL de alcohol
absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.
Montar sobre el matraz una alargadera para
introducción de un gas refrigerante. Introducir una ligera corriente de gas
nitrógeno, y calentar durante 30 min a 70°C en un baño de agua ebulliendo
provisto de agitadores magnéticos.
Nota:
Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.
B.23.5.3
Extracción del Insaponificable
Una vez terminada la saponificación, enfriar
el matraz a temperatura ambiente y transvasar la suspensión a un embudo de
separación de 500 mL.
Enjuagar con máximo 30 mL de agua fría en 3
porciones de 10 mL que se añaden al contenido del embudo de separación. Evitar
un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones.
En seguida enjuagar el matraz con 50 mL de
éter de petróleo (rango de 40-60°C) en varias porciones que se añaden al embudo
de separación. Extraer la vitamina D3 agitando ligeramente. Dejar separar las
fases.
Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación
de 500 mL. Recojer la fase orgánica en un tercer embudo de separación de 500
mL.
Efectuar esta extracción 5 veces en total.
Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar emulsiones.
Lavar la solución orgánica con porciones de
100 mL de agua adicionándola por las paredes del embudo, sin agitar, hasta que
el agua de lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del
último lavado, esperar al menos 15 min antes de vaciar la fase acuosa.
Filtrar la solución lavada en continuo a través
de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de sodio anhídro o en
un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en
forma de pera de 500 mL , sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el
filtro con 50 mL de éter de petróleo.
Evaporar el disolvente bajo presión reducida
en un rotavapor a 40°C, y eliminar los últimos mililitros mediante una
corriente de nitrógeno.
Transvasar el residuo cuantitativamente a un
matraz aforado de 5 mL, mediante pequeñas porciones de fase móvil (B.20.4.1)
llevar al volumen y filtrar la solución inmediatamente a través de un filtro de
0,45 µ de tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos, por ejemplo
Acrodisc - CR o equivalente; recoger el filtrado en un matraz en forma de pera.
El filtrado debe ser límpido.
La solución está lista para la
cromatografía.
B.23.5.4
Cromatografía Preparativa
Condiciones:
|
Columna |
Spherisorb Si, 5 mcm, 4,6 X 250 mm |
|
Loop de
inyección |
500 µl |
|
Fase móvil |
1% 2-propanol en
n-hexano (B.2.3.1) |
|
Caudal |
1-3 mL/min (el
tiempo de retención de la vitamina D3 debe ser de aproximadamente 5 min |
|
Detector |
espectrofotómetro,
longitud de onda variable, ajustada a 264 nm (o eventualmente
espectrofotómetro de longitud de onda fija a 254 nm, únicamente utilizable
para la etapa preparativa), 0,05 AUFS para el patrón y 0,5 AUFS para el
extracto de muestra |
|
Registrador |
10 mm/min |
Inyectar primero 500 µl de solución patrón
de vitamina D3 (B.20.4.4) y determinar el tiempo de retención: debe ser
aproximadamente 5 min. Inyectar a continuación la solución de la muestra
obtenida bajo el numeral B.20.5.3 y recoger la fracción que contiene la
vitamina D3 en un matraz en forma de pera de 10 mL. Comenzando a recoger
aproximadamente 1 min antes de la elución de la vitamina D3 y parar
aproximadamente 1 min después de la elución de la vitamina D3.
B.23.5.5
Cromatografía Analítica
Evaporar a seco la fracción recogida bajo
20.5.4, mediante una ligera corriente de nitrógeno.
Enfriar el matraz a fin de evitar errores de
volumen a una evaporación eventual de disolvente; luego tomar el residuo en 300
µl de fase móvil (B.20.4.2), agitar ligeramente para disolver bien el residuo.
Condiciones:
|
Columna |
Spherisorb ODS, 5 mcm, 4,6 X 250 mm |
|
Loop de
inyección |
100 µl |
|
Fase móvil |
10%
diclorometano, 89% acetonitrilo y 1% de 2-propanol |
|
Caudal |
2 mL/min |
|
Detector |
espectrofotómetro,
longitud de onda variable, ajustada a 264 nm; 0,01 AUFS |
|
Registrador |
10 mm/min |
Inyectar primero 100 µl de solución patrón
(B.20.4.5) y determinar el tiempo de retención: debe ser aproximadamente 8-9
min (adaptar la proporción de diclorometano/acetonitrilo si es necesario).
Luego inyectar 100 µl de la fracción obtenida bajo B.20.5.4.
B.23.6 Cálculo, Expresión e Interpretación de los
Resultados
B.23.6.1
Evaluación
Identificar el pico de la vitamina D3 en el
cromatograma de la muestra mediante el tiempo de retención definido por
cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los picos obtenidos
durante la cromatografía de la solución patrón y de la solución muestra.
El contenido en vitamina D3, expresado en
Unidades Internacionales por 100 g de producto, es igual a:
hp x C x Vo x V2 x 100
Hs x m x V1
En donde:
m = toma de ensayo, en gramos
hp = altura del pico
de la muestra, en mm
hs = altura del pico
de la solución patrón, en mm
C = concentración de la solución patrón
inyectada, en U.I./ mL
Vo = volumen en el
cual ha sido diluido el residuo antes de la cromatografía preparativa (20.5.3)
(en general 5 mL= matraz aforado)
V1 = volumen del extracto inyectado en la columna preparativa (en general
0,500 mL=volumen del loop de inyección)
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la
cromatografía preparativa (en general 0,300 mL)
Nota: es
superfluo un factor de corrección para la isomerización de la vitamina D3, en
previtamina D3, ya que este fenómeno es despreciable en las condiciones de
saponificación aplicadas.
B.23.6.2
Límite de Detección de Acuerdo a la Sensibilidad del Equipo.
Aproximadamente: 20 U.I./100 g
B.23.6.3
Repetibilidad
La diferencia entre dos resultados
individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las mismas
condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo,
no debe exceder 10% de la media entre ambos resultados.
Cuando las vitaminas han sido añadidas por
mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por el grado de
homogeneidad del producto.
APENDICE
INFORMATIVO A
A. LISTA DE
SUSTANCIAS DESINFECTANTES RECOMENDADAS
|
No. |
Solución acuosa de: |
Concentración máx. del ingrediente activo |
Condiciones de empleo |
|
1 |
Hipoclorito cálcico, sódico o potásico, con o sin bromuro cálcico,
sódico o potásico. |
200 mg/kg de halógeno calculado en cloro. |
Escurrir después del tratamiento. No precisa aclarado final |
|
2 |
Acido di y tricloroisocianúrico, o sales potásicas o sódicas de estos
ácido con o sin bromuro potásico, cálcico o sódico. |
100 mg/kg de halógeno calculado en cloro. |
Como en 1 |
|
3 |
Yoduro potásico, p-toluensulfocloramida sódica y lauril sulfato
sódico. |
25 mg/kg de yodo valorable; el nivel de los componentes no debe
superar el mínimo preciso para obtener el efecto funcional deseado. |
Como en 1 |
|
4 |
yodo butoxi-monoéter de etilenglicol + butoximono-éter de
propilenglicol+ butoximonoéter de polialquilenglicol, teniendo un punto de
niebla de 90-100ºC. en solución al 0.5% y un peso molecular medio de 3,300 y
monobutiléter de etilenglicol. Monoetil-éter de dietilenglicol se puede adicionar como componente
opcional. |
25 mg/kg de yodo. Los adyuvantes utilizados con el yodo no deben de
superar la cantidad mínima necesaria para obtener el efecto funcional
deseado. |
Como en 1 |
|
5 |
Yodo, ácido hidroyódico alfa- (p-monofenil-W-hidroxipolil (oxietileno)
(peso molecular medio 748) y/o polioxietilen-polioxipropileno tipo
copolimerización en bloque (peso molecular medio mínimo 1,90). Alcohol
isopropílico se puede adicionar como componente opcional. |
Como en 4 |
Como en 1 |
|
6 |
Yodo, yoduro de sodio, dioctilsulfosuccinato de sodio y
polioxietilen-polioxipropileno tipo copolimerización en bloque (peso
molecular medio mínimo 1,900). |
Como en 4 |
Como en 1 |
|
7 |
Acido dodecilbencenosulfónico, polioxietilen-polioxipropileno, tipo
copolimerización en bloque (peso molecular medio mínimo 2,800). |
400 mg/kg de ácido dodecil-benceno-sulfónico y 80 mg/kg de
polioxietilen-polioxipropileno, tipo copolimerización en bloque (peso
molecular medio mínimo 2,800). |
Estas soluciones se emplean en la limpieza de equipo y utensilios, así
como en botellas y envases para leche; no precisan aclarado final.* |
|
8 |
Yodo, butoxi-monoéter de etilen glicol+butoxi-monoéter de propilenglicol+butoximono-éter
de polialquilenglicol, con un peso molecular medio mínimo de 2,400, y
alfa-lauril-W-hidroxipoli (oxietileno) con un promedio de 8-9 moles de óxido
de etileno y un peso molecular medio de 400. |
Como en 4 |
Estas soluciones se emplean en la limpieza del equipo y utensilios,
así como de envases de leche y otras bebidas. Como aclarado preliminar se
puede utilizar agua a la que se ha añadido esta solución. No se debe emplear
en el enjuagado final.* |
|
9 |
Cloruro de n-alquil-(C12 a C18) bencildimetil-amonio, con un promedio
de peso molecular de 351-380 y conteniendo principalmente cadenas de los
grupos alquilo con 12 a 16 átomos de carbono, con o sin grupos alquilo de 8 a
10 átomos de carbono, en una proporción máxima de 1% respecto a los de 12-16.
Se puede añadir como componente opcional alcohol isopropílico. |
200 mg/kg de compuestos de amonio cuaternario activos. |
Como en 1 |
|
10 |
Tricloromelamina y lauril sulfato sódico o ácido dodecilbenceno
sulfónico. |
Tricloromelamina, en cantidad no superior a la necesaria para producir
200 mg/kg de cloro y lauril sulfato sódico, a un nivel que no exceda del
mínimo requerido para que se presente el efecto funcional deseado o, ácido
dodecilbenceno sulfónico en proporción no superior a 4000 mg/kg |
Estas soluciones se emplean en la limpieza de envases para bebidas,
excepto leche, así como en la higienización del equipo y utensilios y otros
materiales, que puedan contactar con alimentos. No precisan aclarado final.* |
|
11 |
Volúmenes iguales de cloruro de n-alquil (C12 a C18)
bencildimetilamonio y cloruro de n-alquil (C12 a C18)
dimetilbencilamonio, con un peso molecular medio de 384. |
200 mg/kg de compuestos de amonio cuaternarios activos. |
Estas soluciones se utilizan en el tratamiento de equipo y utensilios,
así como las superficies que contactan los alimentos, en establecimientos de
comidas públicas. No precisan aclarado final.* |
|
12 |
Sal sódica del ácido oleico sulfonatado,
polioxietileno-polioxipropileno tipo copolimerización en bloque, con un peso
molecular medio de 2,000 y con 27 a 31 moles de polioxipropileno. |
200 mg/kg de ácido sulfonatado, sal sódica. |
Esta solución se utiliza para botellas u otros envases de vidrio para
leche, así como para el equipo y utensilios empleados en la elaboración de
alimentos. Los artículos tratados con esta solución se deben escurrir durante
15 min antes de ponerlos en contacto con los alimentos. No precisa aclarado
final.* |
|
13 |
Yodo y alquil (C12 - C15) monoéter de etilen y
propilenglicol+ monoéter de polialquilenglicol, con un punto de niebla de
70-77ºC en solución acuosa al 1% y con un peso molecular medio de 807. |
Como en 4 |
Como en 1 |
|
14 |
Yodo, butoxi-monoéter de etilen y propilenglicol+butoximonoéter de
polialquilenglicol, con un punto de niebla de 90-100ºC, en solución acuosa al
0,5% y con un peso molecular medio de 3,300 y
polioxietileno-polioxipropileno, tipo copolimerización en bloque, con un peso
molecular medio mínimo de 2,000. |
Como en 4 |
Como en 1 |
|
15 |
Hipoclorito de litio |
290 mg/kg de cloro y 30 mg/kg de litio. |
Como en 1 |
|
16 |
Cantidades iguales de
cloruro de n-alquil (C12-C18) bencil-dimetil-amonio y cloruro de n-alquil (C12
a C14)-dimetil-(etil-bencil)-amonio (con pesos moleculares medios de
377-384). De forma opcional se puede adicionar etilen-diaminote-tracetato
tetrasódico y/o a-(p-nonil-fenol)-w-hidroxipoli
(oxietileno con un contenido de 11 moles. |
200 mg/kg de compuestos de
amonio cuaternario activo. |
Como en 1 |
|
17 |
Cloruro de di-n-alquil (C8
- C10)-dimetilamonio y alcohol isopropílico, con un peso
molecular medio de 332-361 |
150 mg/kg de compuestos de
amonio cuaternario activo. |
Como en 1 |
|
18 |
Cloruro de n-alquil (C12
-C18) bencil-dimetil-amonio, metaborato sódico, a-terpinol y a- [ p-(1,1,3,3
tetrametil-butil)fenil]-w-hidroxipoli (oxietileno), producido con 1 mol de
fenol y 4-14 moles de óxido de etileno |
200 mg/kg de compuestos de
amonio cuaternario activos y 66 mg/kg de a- [(1,1,3,3 tetrametil-butil)fenil] w-hidroxipoli (oxietileno). |
Como en 1 |
|
19 |
Di-cloro-iso-cianurato
sódico y etilen-diamino-tetracetato tetrasódico. |
100 mg/kg de cloro. |
Como en 11 |
|
20 |
o-fenil-fenol,
o-bencil-p-cloro fenol, p-amilfenol, sulfato de a-alquil- (C12 a C15)-w- hidroxipoli- (oxietileno) y sodio
con un contenido medio de polioxietileno de 1 mol, sales potásicas de ácidos
grasos de aceite de coco y alcohol isopropílico o hexilenglicol. |
800 mg/kg de fenoles
activos totales, que comprenden 400 mg/kg de o-fenil-fenol 320 mg/kg de
o-bencil-p-clorofenol y 80 mg/kg de p-amifenol terciario. |
Unicamente para
aplicaciones de un solo uso. |
|
21 |
Dodecil-benceno-sulfonato
sódico. |
Entre 25 y 430 mg/kg del
producto. |
Como en 1 |
*En otros países,
entre los que no se incluyen Estados Unidos, es obligatorio el aclarado final
con agua después de aplicar la solución desinfectante.
Los
fabricantes podrán emplear otras sustancias para la limpieza y desinfección de
equipo, siempre y cuando se asegure que los productos obtenidos son inocuos
para el consumidor.
APENDICE
INFORMATIVO B
B.1
PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA Y DESCONTAMINACION DEL MATERIAL DE VIDRIO Y AREA DE
TRABAJO PARA LA DETERMINACION DE AFLATOXINAS
B.1 Objetivo
Por la
naturaleza y potenciabilidades tóxicas de las aflatoxinas es importante
establecer directrices para la descontaminación del área de trabajo, material y
equipo utilizados, así como los procedimientos a seguir para neutralizar
derrames y remanentes de extractos de las muestras.
El
trabajo de limpieza y descontaminación será realizado por personal capacitado y
que cuente con equipo protector como una bata, guantes impermeables y lentes
protectores.
B.2 Descontaminación del Material de
Laboratorio
Todo el
material de vidrio del laboratorio que haya sido utilizado durante el análisis
debe sumergirse en una solución de hipoclorito, el cual se prepara diluyendo
una parte de solución comercial de hipoclorito de sodio o clarasol (con una
concentración entre 5 y 6%) con 10 partes de agua, por ejemplo mezclar 100 mL
de blanqueador comercial con 1000 mL de agua.
Después
del tratamiento, el material debe enjuagarse abundantemente con agua corriente
seguido de agua destilada, secar por escurrimiento o en estufa de 90-100°C.
B.3 Descontaminación del Area de Trabajo
La
superficie de las mesas de trabajo y las paredes en las que pudiera haberse
contaminado de leche con aflatoxinas, deben limpiarse con una toalla desechable
impregnada en solución de hipoclorito de sodio o solución blanqueadora
comercial después de cada sesión.
B.4 Descontaminación de Material Desechable
Todo el
material desechable como son las columnas y placas deben sumergirse durante un
mínimo de 5 min en una solución de hipoclorito de sodio utilizando una parte de
blanqueador comercial y diez partes de agua. La solución descontaminadora ya
usada debe eliminarse por el drenaje y los materiales desechables tratados
deben empacarse en una bolsa de plástico sellada para colocarse en el depósito
de desechos.
B.5 Tratamiento de Derrames
Los
derrames de soluciones de aflatoxinas deben tratarse inmediatamente con
hipoclorito de sodio o blanqueador doméstico y vertirlo directamente del
envase, recoger los líquidos con un papel absorbente, el cual también se
colocará en una bolsa de plástico.
B.6 Tratamiento de Remanentes de Extracto de
Muestras
Una vez
que se ha separado una alícuota del extracto de la muestra es frecuente que
permanezca un remanente del mismo. Estos restos de extractos deben tratarse con
una cantidad de blanqueador equivalente a la unidad del volumen del residuo a
tratar. Los líquidos resultantes se deben acumular en un recipiente para
desechos líquidos y eliminarse en un lugar destinado especialmente para este
propósito.
_________________________