NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011, Productos y servicios NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011, Productos y servicios. Bebidas saborizadas no alcohólicas, sus congelados, productos concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína. Especificaciones y disposiciones sanitarias. Métodos de prueba.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en el artículo 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal del Procedimiento Administrativo; 3 fracción XXII, 17 bis fracciones II y III, 17 Bis 2, 115 fracciones IV y VI, 194 fracción I, 195, 199, 210, 212, 215 fracciones II, III y IV y 216 de la Ley General de Salud; 3 fracción XI, 38 fracción II, 40 fracciones I, XI y XII, 41, 43, 47 fracción IV y 52 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 1 fracción VI, 4, 8, 14, 15, 25, 30, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 211 y 214 del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 2 inciso C fracción X y 36 del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud; 3 fracciones I incisos d y l, y II, 10 fracciones IV y VIII del Reglamento de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios, y
CONSIDERANDO
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, el 20 de agosto de 2009, el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, aprobó el anteproyecto de Norma Oficial Mexicana;
Que con fecha 22 de diciembre de 2010 en cumplimiento del acuerdo del Comité y lo previsto en el artículo 47 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, se publicó en el Diario Oficial de la Federación el proyecto de la presente norma, a efecto de que dentro de los siguientes sesenta días naturales posteriores a dicha publicación, los interesados presentarán sus comentarios al Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario.
Que con fecha previa, fue publicada en el Diario Oficial de la Federación la respuesta a los comentarios recibidos por el mencionado Comité, en términos del artículo 47 fracción III de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización.
Que en atención a las anteriores consideraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, tengo a bien expedir y ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-218-SSA1-2011, PRODUCTOS Y SERVICIOS. BEBIDAS SABORIZADAS NO ALCOHOLICAS, SUS CONGELADOS, PRODUCTOS CONCENTRADOS PARA PREPARARLAS Y BEBIDAS ADICIONADAS CON CAFEINA. ESPECIFICACIONES Y DISPOSICIONES SANITARIAS. METODOS DE PRUEBA.
PREFACIO
En la elaboración de la presente norma participaron las siguientes Dependencias, Instituciones y Organismos:
Secretaría de Salud
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios
Secretaría de Salud del Estado de Michoacán
Secretaría de Salud del Estado de Nuevo León
Secretaría de Economía
Procuraduría Federal del Consumidor
Dirección General de Investigación
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Química
Confederación de Cámaras Industriales de los Estados Unidos Mexicanos
Cámara Nacional de la Industria de la Transformación
Cámara Nacional de la Industria de Conservas Alimenticias
Asociación Nacional de Productores de Refrescos y Aguas Carbonatadas, A.C.
Asociación Nacional de Fabricantes de Productos Aromáticos, A.C.
Bebidas Sanas, S.A. de C.V.
Bebidas Energizantes en México A.C.
Cadbury Bebidas, S.A. de C.V.
Café Internacional de Córdoba, S.A. de C.V.
Centro de Capacitación de Calidad Sanitaria, S.A. de C.V.
Centro de Control Total de Calidades, S.A. de C.V.
Coca Cola de México, S.A. de C.V.
Concentrados Sandy ´s, S.A. de C.V.
DULCO, S.A. de C.V.
Embotelladora AGA de México, S.A. de C.V.
GAF Distribuciones Industriales, S.A. de C.V.
Grupo JUMEX
Helados Siberia, S.A. de C.V.
Innovadora de Esencias, Aromas y Sabores, S.A. de C.V.
Jarabes el Manantial, S.A. de C.V.
Jugos del Valle, S.A. de C.V.
KRAFT Foods de México, S. de R.L. de C.V.
Manantiales Peñafiel, S.A. de C. V.
Mead Johnson de México, S. de R.L. de C.V.
Nestle México, S.A. de C.V.
OMNILIFE, S.A. de C.V.
Paleterías la Michoacana, S.A. de C.V.
Parmalat de México, S.A. de C.V.
Procesadora de Frutas La Cima, S.A. de C.V.
Procter & Gamble México, S. de R.L. de C.V.
Productora Nacional de Concentrados, S.A. de C.V.
SABORMEX, S.A. de C.V.
Santa Clara Productos Lácteos, S.A. de C.V.
SAROMA, S.A. de C.V.
Super Sopas, S.A. de C.V.
UNILEVER de México, S.A. de C.V.
INDICE
1. Objetivo y campo de aplicación
2. Referencias
3. Definiciones
4. Símbolos y abreviaturas
5. Disposiciones generales
6. Bebidas saborizadas no alcohólicas y bebidas adicionadas con cafeína
7. Productos congelados
8. Productos concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas
9. Muestreo
10. Métodos de prueba
11. Etiquetado
12. Envase
13. Concordancia con normas internacionales
14. Bibliografía
15. Observancia de la norma
Apéndice Normativo A. Listado de Aditivos
Apéndice Normativo B. Métodos de prueba
1. Objetivo y campo de aplicación.
1.1 Esta norma establece las disposiciones y especificaciones sanitarias que deben cumplir las bebidas saborizadas no alcohólicas (incluye bebidas para deportistas), sus congelados, los productos concentrados para prepararlas y las bebidas adicionadas con cafeína.
1.2 Esta norma no aplica a productos que cuenten con una regulación sanitaria particular, los cuales deben ajustarse a las especificaciones sanitarias que para cada uno de ellos determine la Secretaría de Salud.
1.3 Esta norma es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional para las personas físicas o morales que se dedican a su proceso o importación.
2. Referencias.
Esta norma se complementa con las siguientes Normas Oficiales Mexicanas, sus modificaciones o las que las sustituyan:
2.1 Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA1-2006. Salud ambiental. Requisitos sanitarios que debe satisfacer el etiquetado de pinturas, tintas, barnices, lacas y esmaltes.
2.2 Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994. Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales.
2.3 Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010. Especificaciones Generales de Etiquetado para Alimentos y Bebidas no alcohólicas preenvasados-Información comercial y sanitaria.
2.4 Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud ambiental, agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.
2.5 Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995. Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.
2.6 Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002. Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias.
2.7 Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009. Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios.
3. Definiciones.
Para fines de esta norma se entiende por:
3.1 Adicionar, añadir uno o más nutrimentos, contenidos o no normalmente en el producto.
3.2 Aditivo, cualquier sustancia permitida que, sin tener propiedades nutritivas, se incluya en la formulación de los productos y que actúe como estabilizante, conservador o modificador de sus características organolépticas, para favorecer ya sea su estabilidad, conservación, apariencia o aceptabilidad.
3.3 Agua para uso y consumo humano (agua potable), agua que no contiene contaminantes objetables, químicos o agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos para la salud.
3.4 Bebida no alcohólica, cualquier líquido, natural o transformado, que proporcione al organismo elementos para su nutrición.
3.5 Bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición, a los que se les disminuyen, eliminan o adicionan uno a más nutrimentos, tales como hidratos de carbono, proteínas, lípidos, vitaminas, minerales o fibras dietéticas.
3.6 Bebida para deportistas, a las bebidas saborizadas no alcohólicas que son elaboradas por la disolución de sales minerales, edulcorantes u otros ingredientes con el fin de reponer el agua, energía y electrolitos perdidos por el cuerpo humano durante el ejercicio.
3.7 Bebidas saborizadas no alcohólicas, a los productos elaborados por la disolución en agua para uso y consumo humano, de edulcorantes e ingredientes opcionales, adicionados o no de aditivos, que pueden estar o no carbonatadas. Incluye bebidas para deportistas.
3.8 Bebida adicionada con cafeína, a los productos elaborados por la disolución en agua para uso y consumo humano, de azúcares, ingredientes opcionales, adicionados o no de aditivos que pueden estar o no carbonatadas y con un contenido mayor de 20 mg de cafeína por 100 ml de producto. No incluye al café, sucedáneos del café, té e infusiones de hierbas.
3.9 Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), en el caso de los aditivos se refiere a la cantidad mínima indispensable para lograr el efecto deseado.
3.10 Concentrado, al producto para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas, que se elabora a partir de derivados vegetales o, saborizantes naturales, idénticos a los naturales o sintético artificiales, adicionado o no de otros aditivos para alimentos y de ingredientes opcionales, destinado para su venta al consumidor.
3.11 Concentrado de manufactura, al producto para preparar bebidas no alcohólicas, que se elabora a partir de derivados vegetales o saborizantes naturales, idénticos a los naturales o sintético artificiales, adicionado o no de otros aditivos para alimentos y de ingredientes opcionales y, que no está destinado para su venta al consumidor.
3.12 Congelado de bebidas no alcohólicas, al producto elaborado con agua para uso y consumo humano, edulcorantes e ingredientes opcionales, adicionados o no de aditivos para alimentos con o sin incorporación de aire y que puede ser moldeado, envasado o empalillado, entre otros.
3.13 Consumidor, persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final productos alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados.
3.14 Contaminación, presencia de materia extraña, sustancias tóxicas o microorganismos, en cantidades que rebasen los límites permisibles establecidos por la Secretaría de Salud o en cantidades tales que representen un riesgo a la salud.
3.15 Derivados vegetales, a las materias primas comestibles e inocuas obtenidas de las diferentes partes de la plantas. Los saborizantes de origen natural son considerados aditivos.
3.16 Envase, cualquier recipiente, o envoltura en el cual está contenido el producto preenvasado para su venta al consumidor.
3.17 Etiqueta, cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva o gráfica, escrita, impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepuesta o fijada al envase del producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del producto, al embalaje.
3.18 Ingrediente, cualquier sustancia o producto, incluidos los aditivos, que se emplee en la fabricación, elaboración, preparación o tratamiento de un alimento o bebida no alcohólica y esté presente en el producto final, transformado o no.
3.19 Inocuo, lo que no hace o causa daño a la salud.
3.20 Jarabe, al producto elaborado con agua para consumo humano, con una concentración de azúcares en cantidad suficiente para lograr la consistencia deseada y que haya sido sometido a tratamiento térmico que asegure su conservación.
3.21 Límite máximo, a la cantidad establecida de aditivos, microorganismos, parásitos, materia extraña, plaguicidas, metales pesados y metaloides, que no se deben exceder en un alimento, bebida o materia prima.
3.22 Lote, a la cantidad de un producto, elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades homogéneas e identificado con un código específico.
3.23 Materia extraña, cualquier sustancia, resto, desecho o material que se presenta en el producto pero que no forma parte de la composición normal de éste.
3.24 Metal pesado y metaloide, a los elementos químicos que causan efectos indeseables en el metabolismo aun en concentraciones bajas. Su toxicidad depende de las dosis en que se ingieran así como de su acumulación en el organismo.
3.25 Método de prueba, al procedimiento analítico utilizado para comprobar que un producto, satisface las especificaciones que establece la norma.
3.26 Nutrimento, cualquier sustancia incluyendo a las proteínas, aminoácidos, grasas o lípidos, carbohidratos o hidratos de carbono, agua, vitaminas y nutrimentos inorgánicos (minerales) consumida normalmente como componente de un alimento o bebida no alcohólica que:
a) Proporciona energía; o
b) Es necesaria para el crecimiento, el desarrollo y el mantenimiento de la vida; o
c) Cuya carencia haga que se produzcan cambios químicos o fisiológicos característicos.
3.27 Polvo para preparar bebidas no alcohólicas, al producto con o sin azúcares, con o sin edulcorantes calóricos y no calóricos, adicionados o no de jugo, leche y aditivos para alimentos.
3.28 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación, preparación, conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, almacenamiento y expendio o suministro al público de productos.
3.29 Productos concentrados para preparar bebidas no alcohólicas, a los productos obtenidos por la mezcla de algunos de los siguientes: azúcares, ingredientes opcionales y aditivos, que requieren diluirse o disolverse para su consumo.
3.30 Producto preenvasado, al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza, no se encuentra presente el consumidor y la cantidad de producto contenido en él no puede ser alterada, a menos que el envase sea abierto o modificado perceptiblemente.
3.31 Tratamiento térmico, al método físico que consiste en someter a una fuente de calor suficiente por un tiempo apropiado al producto, antes o después de ser envasado con el fin de lograr una estabilidad biológica y que garantice la eliminación de microorganismos patógenos.
4. Símbolos y abreviaturas.
Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:
BPF buenas prácticas de fabricación
cm centímetro
g gramo
kg kilogramo
L, l litro
M masa
µg microgramos
mg miligramo
mL, ml mililitro
n.a. no aplica
nm nanómetro
NMP número más probable
/ por
% por ciento
UFC unidades formadoras de colonia
UV ultravioleta
pH potencial de hidrógeno
v volumen
v/v relación volumen-volumen
°C grado Celsius
< menor que
PEPS primeras entradas, primeras salidas
Cuando en la presente norma se mencione al:
Acuerdo de aditivos, debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las sustancias permitidas como aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios vigente.
Acuerdo de plantas, debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las plantas prohibidas o permitidas para tés, infusiones y aceites vegetales comestibles, vigente.
Reglamento, debe entenderse que se trata del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.
Secretaría, debe entenderse que se trata de la Secretaría de Salud.
5. Disposiciones generales.
5.1 En el proceso de los productos objeto de esta norma, además de cumplir con lo establecido en el Reglamento, deberán ajustarse a las siguientes disposiciones:
5.1.1 Los establecimientos que se dediquen al proceso de los productos objeto de esta norma, deben cumplir con lo establecido en la Norma citada en el numeral 2.7 del apartado de referencias.
5.1.2 Instalaciones físicas.
5.1.2.1 Cuando por las características del envase se requiera un área de lavado de envases, ésta debe ser específica, localizarse dentro del establecimiento y contar con pisos, paredes y techos. En caso de que no exista comunicación directa entre esta área y la de llenado, se deben tomar las medidas necesarias para evitar la recontaminación de los envases.
5.1.3 Materia prima.
5.1.3.1 La materia prima empleada en la elaboración de los productos objeto de esta norma, debe cumplir con lo establecido en el Reglamento y en las Normas Oficiales Mexicanas correspondientes.
5.1.3.2 El agua que se utilice en el proceso de los productos debe ser para uso y consumo humano, conforme a lo establecido en las Normas citadas en los numerales 2.4 y 2.6 del apartado de referencias y en caso de ser necesario, se debe contar con un sistema de potabilización adicional que garantice su inocuidad. El mantenimiento del mismo es responsabilidad del particular, de acuerdo con las especificaciones emitidas por el fabricante.
5.1.3.3 La materia prima de origen vegetal fresca o congelada, se debe lavar con agua para uso y consumo humano, y desinfectar con sustancias inocuas para su uso en alimentos, de conformidad con lo siguiente:
5.1.3.3.1 El agua debe cambiarse con una frecuencia suficiente para prevenir la acumulación de materia orgánica y evitar la contaminación cruzada.
5.1.3.3.2 Debe realizarse el secado o drenado para eliminar el agua después del lavado.
5.2 Especificaciones generales.
5.2.1 Los productos sujetos a tratamiento térmico envasados en recipientes de cierre hermético, además de cumplir con lo establecido en este ordenamiento, deben cumplir con la Norma citada en el numeral 2.5 del apartado de referencias.
5.2.2 Los productos modificados en su composición, además de cumplir con lo establecido en este ordenamiento, deben cumplir con la Norma citada en el numeral 2.2 del apartado de referencias.
5.2.3 Contenido de alcohol.
5.2.3.1 El contenido de alcohol etílico en el producto terminado no debe exceder del 1,99% y cuando provenga de sabores no debe exceder el 0,5%; ambos porcentajes expresados v/v a 20 °C.
5.2.4 Metales pesados y metaloides.
5.2.4.1 El fabricante de los productos objeto de esta norma, debe establecer mecanismos de control que permitan determinar la presencia y cantidad de metales pesados y metaloides en las materias primas, en el producto en proceso de elaboración o en el producto terminado, de acuerdo a las regulaciones aplicables a la categoría del producto. La información generada debe estar a disposición de la Secretaría cuando ésta así lo requiera.
5.2.5 Los productos objeto de esta norma que empleen como materia prima derivados vegetales, deben sujetarse a lo establecido en el Acuerdo de plantas, así mismo no podrán utilizar aquellas que se encuentran listadas en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos.
5.2.6 Los obsequios o promociones que se proporcionen con los productos objeto de esta norma deben ser inocuos, no ceder sustancias tóxicas al producto y, en su caso, cumplir con los ordenamientos jurídicos aplicables.
5.2.7 Aditivos.
5.2.7.1 En la elaboración de los productos objeto de esta norma, únicamente se permite el empleo de los aditivos listados en el Apéndice normativo A.
5.2.7.2 Los límites establecidos para cada aditivo sólo son aplicables al uso de dichas sustancias como aditivos, sin considerar su empleo como nutrimentos.
5.2.7.3 En la elaboración de los productos objeto de esta norma adicionalmente a lo especificado en el
5.2.7.1, se permite el empleo de saborizantes naturales, sintéticos idénticos a los naturales y sintéticos artificiales, señalados en el Acuerdo de aditivos conforme a las BPF.
5.2.7.4 En la elaboración de congelados a granel pueden emplearse los colorantes listados en los límites señalados en el Apéndice normativo A, de los cuales debe monitorearse y registrarse la concentración en el producto terminado. La presencia de otros aditivos se deberá únicamente al principio de transferencia, cuando se elaboren a partir de concentrados, jarabes o bebidas no alcohólicas preenvasadas.
5.2.8 Las bebidas de quina no deberán contener más de 0,001% de quinina o 0,01% de bisulfato de quinina o de clorhidrato de quinina.
5.2.9 Especificaciones físicas.
5.2.9.1 El límite máximo de materia extraña debe ser:
Tabla 1. Materia extraña
| Materia extraña | Con derivados vegetales | Sin derivados vegetales |
| Bebidas, congelados, jarabes y concentrados | Polvos | Bebidas, congelados, jarabes y concentrados | Polvos |
| Pelo | 1/100 g | 1/50 g | 1/250 mL | 1/50 g |
| Fragmentos de Insectos | 20/100 g | 20/50 g | exento | 10/50 g |
| Fibras | 5/100 g | 5/50 g | 5/100 mL | 5/50 g |
6. Bebidas saborizadas no alcohólicas y bebidas adicionadas con cafeína.
6.1 Disposiciones sanitarias.
6.1.1 Además de lo señalado en el punto 5, las empresas productoras de bebidas saborizadas no alcohólicas preenvasadas y las bebidas adicionadas con cafeína deben cumplir con lo siguiente:
6.1.1.1 Para el caso de envases no retornables vacíos, éstos deben almacenarse en condiciones higiénicas, protegidos de polvo y de materia extraña. Previo a su llenado, deben ser sometidos a un proceso que garantice la inocuidad del producto terminado.
6.1.1.2 Cuando se utilicen envases retornables, éstos deben ser sometidos a un proceso de desinfección interna y de lavado externo con soluciones desinfectantes, enjuagados con agua apta para consumo humano y escurridos de manera que no queden residuos de los desinfectantes.
6.1.1.3 Los tapones, tapas, hermetapas o corcholatas deben ser nuevos de material no tóxico, y mantenerse durante todo el proceso en condiciones higiénicas libres de polvo y de materia extraña. En caso de contaminación, éstas deberán lavarse y desinfectarse con soluciones que no modifiquen, reaccionen o alteren las características de éstos, evitando la contaminación por arrastre.
6.2 Especificaciones Microbiológicas.
6.2.1 Las bebidas saborizadas no alcohólicas y las bebidas adicionadas con cafeína no deben sobrepasar los siguientes límites:
Tabla 2. Especificaciones microbiológicas
| Microorganismos | Límite máximo |
| Mesófilos aerobios UFC/g o mL | 50 |
| Coliformes totales NMP/mL o g | 10 |
| Coliformes fecales NMP/mL o g | n.a. |
| Salmonella spp en 25 mL o g | ausente * |
| E. coli NMP/g o mL | n.a. |
| V. cholerae O1 en 50 g o mL | ausente * |
| Enterotoxina estafilocóccica | negativa* |
* Sólo en casos de contingencia sanitaria.
6.3 Las bebidas adicionadas con cafeína no deben contener más de 33mg de cafeína/100mL de producto.
6.4 Las bebidas para deportistas deben contener, por lo menos sodio e hidratos de carbono en forma de
azúcares, en las siguientes concentraciones:
6.4.1 Sodio entre 230 y 575 mg/L
6.4.2 Hidratos de carbono (azúcares) máximo 80 g/L
7. Productos congelados.
7.1 Clasificación
Los productos objeto de este capítulo se clasifican en:
7.1.1 Preenvasados y
7.1.2 A granel
7.2 Disposiciones sanitarias.
7.2.1 Además de lo señalado en el apartado 5 se deben cumplir con las siguientes disposiciones:
7.2.1.1 En todo momento se debe evitar que la salmuera entre en contacto con el producto terminado.
7.2.1.2 El agua que se utilice durante el desmolde de los productos debe ser para uso y consumo humano.
7.2.1.3 No se permite colocar hielo en contacto directo con el producto terminado, a menos que éste se encuentre preenvasado, de tal forma que evite su contaminación.
7.2.1.4 La cámara de congelación y congeladores o neveras deben mantenerse a una temperatura de -12 °C o menos, con termómetro visible o dispositivos de registro de temperaturas funcionando y en buen estado; y permitir el flujo de aire entre los productos.
7.2.1.5 Los congelados de bebidas saborizadas no alcohólicas adicionadas con cafeína deben de cumplir con los límites establecidos en el numeral 6.3.
7.3 Especificaciones Microbiológicas.
7.3.1 Los congelados de bebidas saborizadas no alcohólicas no deben sobrepasar los siguientes límites:
Tabla 3. Especificaciones microbiológicas para los congelados de las bebidas saborizadas no alcohólicas
| Microorganismos | Congelados de bebidas saborizadas no alcohólicas preenvasados | Congelados de bebidas saborizadas no alcohólicas a granel |
| sin derivados vegetales | con derivados vegetales |
| Con tratamiento térmico | Sin tratamiento térmico |
| Coliformes totales NMP/mL o g | 10 | 10 | 50 | n.a. |
| Coliformes fecales NMP/mL o g | n.a. | n.a. | n.a. | <3** |
| Salmonella spp. / 25 mL o g | ausente* | ausente | ausente | ausente |
| E. coli NMP/mL o g | n.a. | n.a. | n.a. | <3 |
| V. cholerae O1 / 50 mL o g | ausente* | ausente* | ausente* | ausente* |
| Enterotoxina estafilocóccica | negativa*** | negativa*** | negativa*** | negativa*** |
* Sólo en casos de contingencia sanitaria.
** Confirmar la presencia de E. Coli por el método de NMP cuando el parámetro de coliformes fecales esté fuera de especificaciones.
*** Sólo en productos adicionados con leche y sus derivados y en casos de contingencia sanitaria.
8. Productos concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas.
8.1 Clasificación
Los productos objeto de este capítulo, por su proceso se clasifican en:
8.1.1 Jarabes y Concentrados
8.1.1.1Con tratamiento térmico
8.1.1.2 Sin tratamiento térmico
8.1.2 Concentrados de manufactura, y
8.1.3 Polvos
8.2 Disposiciones sanitarias.
8.2.1 Además de lo señalado en el punto 5 las empresas productoras de concentrados de manufactura deben cumplir con lo siguiente:
8.2.1.1 Las características y especificaciones sanitarias de los concentrados de manufactura, utilizados como materia prima para la elaboración de bebidas saborizadas no alcohólicas deben garantizar la inocuidad de estas últimas, a fin de cumplir con las especificaciones sanitarias establecidas en esta norma y demás disposiciones aplicables.
8.2.1.2 Los concentrados de manufactura utilizados como materia prima, deben contar con un certificado de calidad que incluya, entre otros, los siguientes datos: nombre o clave o código del producto, identificación del responsable de proceso, número de lote, leyendas de conservación y la declaración de ingredientes misma información que debe ser declarada en la etiqueta, a excepción de los ingredientes. Cuando se requiera utilizar una clave o código para referirse al nombre del producto o a los ingredientes, la persona física o moral, licenciatario o causahabiente, propietaria de la marca debe contar con la documentación que respalde la identificación de los mismos, la cual debe estar a disposición de la Secretaría cuando ésta lo requiera.
8.3 Especificaciones Físicas y Químicas.
8.3.1 Los polvos para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas no deben exceder de 5% de humedad.
8.4 Especificaciones Microbiológicas.
8.4.1 Los jarabes y concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas deben cumplir con los límites máximos siguientes:
Tabla 4. Especificaciones microbiológicas en jarabes y concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas.
| Microorganismo | Con tratamiento térmico | Sin tratamiento térmico. |
| sin derivados vegetales. | con derivados vegetales. |
| Coliformes totales UFC/ g o mL | <10 | 10 | n.a. |
| Coliformes fecales NMP/ g o mL | n.a. | n.a. | <3** |
| Salmonella spp. / 25 g o mL | ausente* | ausente* | ausente |
| E. coli NMP/mL o g | n.a. | n.a. | <3 |
| Enterotoxina estafilocóccica | negativa * | negativa * | negativa * |
* En caso de contingencia sanitaria.
** Confirmar la presencia de E. coli por el método de NMP cuando el parámetro de coliformes fecales esté fuera de especificaciones.
8.4.2 Los polvos para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas deben cumplir lo siguiente:
Tabla 5. Especificaciones microbiológicas en polvos para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas.
| Microorganismos | Límite máximo |
| Mesofílicos aerobios UFC/g | 5000* |
| Coliformes totales NMP/g | <10 |
| Escherichia coli NMP/g | <3** |
| Salmonella spp. en 25 g | ausente** |
*Para aquellos que contengan cacao o leche el límite máximo es de 7000 UFC/g.
**En aquellos productos que contengan cacao, huevo o leche (incluyendo sus derivados)
9. Muestreo.
El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta norma, debe sujetarse a lo que establece la Ley General de Salud y otras disposiciones jurídicas aplicables.
10. Métodos de prueba.
Para la verificación oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta norma, se deben aplicar los métodos de prueba establecidos en el Apéndice normativo B.
11. Etiquetado.
Las etiquetas o envases de los productos preenvasados objeto de esta norma, además de cumplir con lo establecido en el Reglamento y en la Norma citada en el numeral 2.3 del apartado de referencias, deben cumplir con lo siguiente:
11.1 Requisitos generales.
11.1.1 Los productos que hayan sido modificados en su composición, deben cumplir con la Norma citada en el numeral 2.7 del apartado de referencias.
11.1.2 En el caso de que el producto haya sido objeto de tratamiento térmico, para asegurar la inocuidad del producto, esta condición debe señalarse en cualquier parte de la etiqueta. Si el producto ha sido sujeto a otro tipo de tratamiento se puede indicar el nombre de éste.
11.2 Lista de ingredientes.
11.2.1 En las bebidas adicionadas con cafeína debe declararse en la lista de ingredientes la cafeína, el o los ingredientes base o la mezcla de éstos, seguido del contenido exacto de cafeína expresado en mg/100 mL, que debe corresponder al total ya sea por el saborizante, el o los ingredientes base o la mezcla de éstos.
11.3 Instrucciones de uso.
11.3.1 Los jarabes o concentrados, cuando aplique, deben ostentar la leyenda: "Agítese antes de su consumo" o cualquier otra equivalente.
11.4 Leyendas de conservación.
11.4.1 Los congelados de bebidas no alcohólicas preenvasados deben ostentar la leyenda: "Manténgase en congelación" o "Consérvese en congelación" o cualquier otra equivalente.
11.4.2 Los polvos deben ostentar la leyenda: "Consérvese en un lugar fresco y seco" o cualquier otra equivalente.
11.4.3 Para los jarabes o concentrados deben ostentar la leyenda: "Refrigérese después de abrirse" o "Manténgase en congelación" o cualquier otra equivalente.
11.5 Etiquetado nutrimental.
11.5.1 Las bebidas para deportistas además, de la información nutrimental obligatoria que establece la Norma citada en el numeral 2.3 del apartado de referencias, deben incluir los electrolitos y minerales que aporten.
11.5.2 Quedan exceptuados de incluir la información nutrimental los concentrados de manufactura.
11.6 Leyendas precautorias.
11.6.1 En productos que contienen quinina debe indicarse la presencia de la misma, ya sea que se utilice la palabra "quinina" en la denominación del producto o empleando una leyenda por separado, la cual deben escribirse con caracteres mayores a la de los ingredientes.
11.6.2 En congeladas, debe incluirse la leyenda: "Para protección de la salud, deben lavarse las manos y el envase del producto antes de consumirlo" o leyenda análoga.
11.6.3 Las bebidas adicionadas con cafeína, deben incluir las siguientes leyendas: "No consumir más de ___ unidades al día" (en el espacio en blanco indicar la cantidad correspondiente, dependiendo de la concentración de cafeína, en ningún caso la ingesta de cafeína por el consumo de estas bebidas debe exceder de 165 mg de cafeína por día).
En un recuadro en letras mayores a la de los ingredientes, se establecerán las siguientes leyendas de advertencia "No se recomienda su consumo por niños menores de 12 años, mujeres embarazadas o lactando, personas sensibles a la cafeína, ni la mezcla con bebidas alcohólicas".
11.7 Especificaciones para productos a granel.
11.7.1 Durante el expendio de los congelados a granel y en caso de que contengan cafeína adicionada en cantidad superior a 20mg/100ml, deben indicar por cualquier medio que el producto contiene dicho ingrediente.
11.7.2 Durante el expendio de congelados a granel y en caso de que contengan quinina, deben indicar por cualquier medio que el producto contiene dicho ingrediente.
12. Envase.
12.1 Debe garantizarse la inocuidad de las tintas empleadas en la etiqueta cuando por las características del producto y el envase primario, se presente el riesgo de ingerirlas; según lo que establece la Norma citada en el numeral 2.1 del apartado de referencias.
13. Concordancia con normas internacionales.
Esta norma no es equivalente con ninguna norma internacional.
14. Bibliografía.
14.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización.
14.2 Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización.
14.3 Ley General de Salud.
14.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.
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14.9 Barr, S.I.; Costill, D.L. and Fink W.J. 1991. Fluid replacement during prolonged exercise: effects of water, saline, or no fluid. Med. Sci. Sports Exerc. 23(7):811-7.
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14.12 Codex Alimentarius Commission. 2001. Informe de la 33a. Reunión del Comité del Codex sobre aditivos alimentarios y contaminantes de los alimentos. La Haya, Países Bajos.
14.13 Comité Mixto FAO/OMS de expertos en Aditivos Alimentarios 1995. Evaluación de ciertos aditivos alimentarios y contaminantes de los alimentos. 44a. Informe Roma Italia.
14.14 Couturier-EG; Laman-DM; VAN-Duijn-MA; VAN-Duijn-H. 1997. Influence of caffeine and caffeine withdrawal on headache and cerebral food flow velocities. Cephalagia. 17(3):188-90.
14.15 Curtis-KM; Savitz-DA and Arbuckle-TE.1997. Effects of cigarette smoking, caffeine consumption, and alcohol intake on fecundability. Am -J-Epidemiol. 146(1):32-41.
14.16 Directiva 92/2/CEE de la Comisión, de 13 de enero de 1992, por la que se establece el procedimiento de muestreo y el método comunitario de análisis para el control oficial de las temperaturas de los alimentos ultracongelados destinados al consumo humano.
14.17 Directiva 2010/69/UE de la Comisión, de 22 de octubre de 2010 por la que se modifican los anexos de la Directiva 95/2/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, relativa a aditivos alimentarios distintos de los colorantes y edulcorantes.
14.18 D'ius-PB. 1997. Caffeine and children. Vopr Pitan. 1:39-41
14.19 Erickson, M.A., Schwarzkopf, R.J. and Mckenzie, R.D. 1987. Effects of caffeine, fructose, and glucose ingestion on muscle glycogen utilization during exercise. Med. Sci. Sports Exerc 19(6):579-583.
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14.37 Othmen-Kirk. 1984. Carbonated beverages. Encyclopedia of Chemical Technology. 3 Ed. pp. 710-712.
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14.40 Rosenstein, S. E. y J.A. Sanchez. 1998. Diccionario de Especialidades para la Industria Alimentaria. Editorial PLM, 8va Ed. México.
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14.43 Shirreffs, S.M.; Taylor, A.J.; Leiper, J.B. and Maughan, R.J. 1996. Post-exercise rehydration in man: effects of volume consumed and drink sodium content. Med Sci. Sports Exerc. 28(10):1260-71.
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15. Vigencia.
15.1 La presente norma entrará en vigor a los 365 días naturales posteriores al de su publicación en el Diario Oficial de la Federación.
16. Observancia de la norma.
16.1 La vigilancia en el cumplimiento de la presente norma corresponde a la Secretaría de Salud y a los gobiernos de las Entidades Federativas, en sus respectivos ámbitos de competencia.
Sufragio Efectivo. No Reelección.
México, Distrito Federal, a 9 de diciembre de 2011.- El Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, Mikel Andoni Arriola Peñalosa.- Rúbrica.
Apéndice normativo A. Listado de aditivos
| Aditivo
| Productos
| Límite máximo en el
producto listo para
consumo mg/L
|
| Aceite vegetal bromado1 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 15
|
| Acetato isobutirato de sacarosa | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 500
|
| Acido benzoico, benzoato de sodio, benzoato de potasio y benzoato de calcio3 (expresado como ácido benzoico) | Bebidas, jarabes, polvos, concentrados y concentrados
de manufactura
| 600
|
| Acido fosfórico | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 700
|
| Acido L (+ ) â tartárico | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 2000
|
| Acido sórbico, sorbato de sodio, sorbato de potasio3 (expresado como ácido sórbico ) | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 1000
|
| Alginato de propilenglicol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 500
|
| Amarillo ocaso FCF y sus lacas4 Amarillo alimentos 3 y sus lacas N ° C.I. 15895 (SIN 110) | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Azorrubina y sus lacas4 Rojo alimentos 3 y sus lacas Carmoisina N ° C.I. 14720 (SIN 122) | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Azul brillante FCF y sus lacas4 Azul alimentos 2 y sus lacas N ° C.I. 42090 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Beta-apo-8'-carotenal Anaranjado alimentos 6 N ° C.I. 40820 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Beta caroteno sintético Anaranjado alimentos 5 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Beta-ciclodextrina | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 500
|
| Bisulfito de potasio6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| Butilhidroxianisol 2 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 1000
|
| Butilhidroxitolueno 2 | Bebidas y congelados
| 1000
|
| Cafeína | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 200
|
| Cantaxantina Anaranjado alimentos 8 N ° C.I. 40850 | Congelados
| 100
|
| Carotenos naturales Anaranjado alimentos 5 N ° C.I. 75130 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Cera de abeja5 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 200
|
| Cera de candelilla5 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 200
|
| Cera de carnauba5 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 200
|
| Citrato de amonio férrico | Polvos, jarabes y concentrados
| 10
|
| Citrato de estearilo | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 500
|
| Citrato de isopropilo2 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 200
|
| Citrato trietilo | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 200
|
| Cloruro de estaño | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 20
|
| Color caramelo Clase III | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 5,000
|
| Color caramelo Clase IV | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 50,000
|
| d-alfa- tocoferol concentrado | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 20
|
| Dicarbonato de dimetilo | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 250
|
| Dioctil sulfosuccinato de sodio | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 10
|
| Dióxido de azufre6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| dlâalfa-tocoferol | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 20
|
| Eritrosina Rojo alimentos 14 N ° C.I. 45430 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Estearato de ascorbilo | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 1000
|
| Estearato de polioxietileno (40) | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 500
|
| Estearoil 2 lactilato de calcio | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 2000
|
| Estearoil 2 lactilato de sodio | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 2000
|
| Ester de glicerol de madera rosina | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 150
|
| Ester de glicerol de goma rosina | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 150
|
| Esteres de glicerol de ácidos grasos y ácido diacetil tartárico | Bebidas, congelados, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 1000
|
| Esteres de poliglicerol de ácidos grasos | Bebidas y congelados
| 300
|
| Esteres de poliglicerol del ácido ricinoléico interésterificado | Bebidas y congelados
| 300
|
| Esteres de propilenglicol de ácidos grasos | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 500
|
| Esteres de ácidos grasos y sacarosa | Bebidas y congelados
| 1000
|
| Etilendiamino tetracetato disódico | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 200
|
| Etilendiamino tetracetato cálcico disódico | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 200
|
| Extracto de annato (Extracto de semillas de Bixa orellana) Anaranjado natural 4 N ° C.I. 75120 | Concentrados de manufactura
| 50
|
| Extracto de cochinilla Extracto de Coccus cacti L Rojo Natural 4 Carmín N ° C.I. 75470 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Extracto de quilaya | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 508
|
| Extracto de tegumento de uva (extracto de piel de uva) | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 3009
|
| Fosfato dihidrogenado de calcio | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 500
|
| Fosfato dihidrogenado de sodio | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 500
|
| Fosfato hidrogenado disódico | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 500
|
| Fosfato tricálcico | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 700
|
| Fosfato tripotásico | Bebidas, congelados, y concentrados de manufactura
| 700
|
| Fosfato trisódico | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 700
|
| Galato de propilo2 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 1000
|
| p-hidroxibenzoato de metilo | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 500
|
| Indigotina y sus lacas4 Azul alimentos 1 y sus lacas N ° C.I. 73015 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 100
|
| L (+) Tartrato de potasio | Bebidas y concentrados de manufactura
| 300
|
| L (+) Tartrato de sodio | Bebidas y concentrados de manufactura
| 300
|
| Metabisulfito de potasio6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| Metabisulfito de sodio6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| Monoestearato de sorbitán | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 500
|
| Monoestearato de sorbitán polioxietilenado (20) | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 500
|
| Monolaurato de sorbitán polioxietilenado (20) | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 100
|
| Monooletato de sorbitán polioxietilenado (20) | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 500
|
| Oxido de hierro negro Pigmento negro 11 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Oxido de hierro rojo Pigmento rojo 101 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Oxido de hierro amarillo Pigmento amarillo 42 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Oxiestearina | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| BPF
|
| Palmitato de ascorbilo | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 1000
|
| Polidimetilsiloxano | Bebidas, congelados, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 20
|
| Polietilenglicol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 1000
|
| Polifosfato de potasio | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 1000
|
| Polifosfato de sodio | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 1000
|
| Polivinilpirrolidona | Polvos
| 500
|
| Ponceau 4R4 Rojo alimentos 7 N ° C.I. 16255 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 50
|
| Resina de guayaco | Bebidas, congelados y concentrados de manufactura
| 1000
|
| Riboflavina | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 50
|
| Riboflavina- 5'- fosfato de sodio | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 50
|
| Rojo allura AC y sus lacas4 Rojo alimentos 17 y sus lacas N ° C.I. 16035 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 300
|
| Sulfito ácido de calcio6,7 | Bebidas y concentrados de manufactura
| 70
|
| Sulfito ácido de sodio6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| Sulfito de potasio6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| Sulfito de sodio6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| Tartrazina y sus lacas4 Amarillo alimentos 4 y sus lacas N ° C.I. 19140 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
| Tiosulfato de sodio6,7 | Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados
de manufactura
| 70
|
| Tocoferoles concentrados (mezcla) | Bebidas, congelados, polvos y concentrados de
manufactura
| 20
|
| Triestearato de sorbitán polioxietilenado (20) | Congelados y concentrados de manufactura
| 500
|
| Verde rápido FCF y sus lacas4 Verde alimentos 3 y sus lacas N ° C.I. 42053 | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y
concentrados de manufactura
| 100
|
1Indice de yodo = 16,0; Acidos grasos libres (como ácido oleico) = 2,5%
2 Cantidad máxima referida al peso total de los aceites esenciales.
3 La mezcla no debe exceder de 1000 mg/L tomando en cuenta el límite máximo de cada aditivo.
4 Si se utiliza una mezcla de colorantes artificiales, ésta no deberá exceder de 100 mg/L en el producto listo para el consumo, tomando en cuenta el límite máximo de cada colorante.
5 Como resultado de la utilización de aspartame como vehículo de sabor.
6 Según se sirve al consumidor.
7 Como SO2 residual.
8 130 mg/kg extracto seco en bebidas semicongeladas.
9 Expresado como antocianina.
Edulcorantes
Además de los edulcorantes establecidos en la NOM-086-SSA1-1994, establecida en el apartado de referencias, se podrán utilizar los siguientes edulcorantes bajo los límites establecidos.
| Aditivo
| Productos
| Límite máximo en el
producto listo para
consumo mg/L
|
| Alitame | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | 40
|
| Aspartame-acelsufame potásico | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | 350
|
| Ciclamato y sus sales de sodio y calcio | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | 350
|
| Eritritol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | BPF
|
| Estevia o glucósidos de estevia | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | 200
|
| Jarabe de maltitol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | BPF
|
| Jarabe de poliglicitol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | BPF
|
| Jarabe de sorbitol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | BPF
|
| Lactitol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | BPF
|
| Maltitol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | BPF
|
| Manitol | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | BPF
|
| Neotame | Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura | 33
|
Lista de aditivos para uso conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación:
Acetato de almidón
Acetato de amonio
Acetato de calcio
Acetato de potasio
Acetato de sodio
Acido acético glacial
Acido algínico
Acido ascórbico, ascorbato de sodio, ascorbato de potasio y ascorbato de calcio (expresado como ácido ascórbico)
Acido cítrico
Acido clorhídrico
Acido D-L-tartárico
Acido eritórbico (expresado como ácido eritórbico)
Acido fumárico
Acido L-glutámico
5'-ácido guanílico
Acido inosínico
Acido láctico
Acido D,L- málico
Acido propiónico (no se permite su uso en congelados)
Acido tánico
Adipato acetilado de dialmidón
Agar
Alginato de amonio
Alginato de calcio
Alginato de potasio
Alginato de sodio
Almidón acetilado oxidado
Almidón blanqueado
Almidón hidroxipropilado, Hidroxipropil de almidón
Almidón oxidado
Almidones tratados con ácidos
Almidones tratados con álcalis
Almidones tratados con enzimas
Carbonato de amonio
Carbonato hidrogenado de amonio
Carbonato de calcio
Carbonato de magnesio
Carbonato de potasio
Carbonato de sodio
Carbonato hidrogenado de magnesio
Carbonato hidrogenado de potasio
Carbonato hidrogenado de sodio
Carboximetilcelulosa de sodio
Carboximetilcelulosa sódica reticulada
Carboximetilcelulosa sódica hidrolizada mediante enzimas
Carragenina
Celulosa en polvo
Celulosa microcristalina
Alfa-ciclodextrina
Gamma-ciclodextrina
Citrato de triamonio
Citrato diácido de potasio
Citrato diácido de sodio
Citrato tricálcico
Citrato tripotásico
Citrato trisódico
Clorofilas, Verde natural 3, N ° C.I. 75810
Cloruro de amonio
Cloruro de calcio
Cloruro de magnesio
Cloruro de potasio
Color caramelo Clase I y II
Dextrinas
Dextrinas, almidón tostado
Dialmidón glicerol
Dialmidón glicerol acetilado
Dióxido de carbono
Dióxido de silicio amorfo
Dióxido de titanio, Pigmento blanco 6,N ° C.I. 77891
Eritorbato de sodio (expresado como ácido eritórbico)
Esteres acéticos y de ácidos grasos del glicerol
Esteres cítricos y de ácidos grasos del glicerol
Esteres lácticos y de ácidos grasos del glicerol
Etil celulosa
Etilhidroxietilcelulosa
Fosfato de dialmidón acetilado
Fosfato de dialmidón
Fosfato de hidroxipropil dialmidón
Fosfato fosfatado de dialmidón
Fosfato de monoalmidón
Fumarato de sodio
Glicerol
Gluconato de calcio
Gluconato de magnesio
Gluconato de potasio
Gluconato de sodio
Glucono delta lactona
Glutamato de calcio
Glutamato de magnesio
Glutamato monoamónico
Glutamato monopotásico
Glutamato monosódico
Goma arábiga
Goma damar
Goma de algarrobo
Goma gellana
Goma ghatti
Goma guar
Goma karaya
Goma tara
Goma tragacanto
Goma xantana
5'-guanilato disódico
Hidróxido de amonio
Hidróxido de calcio
Hidróxido de magnesio
Hidróxido de potasio
Hidróxido de sodio
Hidroxipropil almidón
Hidroxipropilcelulosa
Hidroxipropil dialmidón glicerol
Hidroxipropilmetilcelulosa
5'-inosinato de calcio
5'-inosinato de potasio
5'-inosinato disódico
Lactato de amonio
Lactato de calcio
Lactato de magnesio
Lactato de potasio
Lactato de sodio
Lecitina
Licopeno
Metil celulosa
Metiletilcelulosa
Monoestearato de glicerilo (Mono y diglicéridos)
Monopalmitato de glicerilo (Mono y diglicéridos)
Nitrógeno
Octenilsuccinato sódico de almidón
Oleorresina de paprika
Oxido de calcio
Oxido de magnesio
Pectinas
Polidextrosa
Propionato de calcio (no se permite su uso en congelados)
Propionato de potasio (no se permite su uso en congelados)
Propionato de sodio (no se permite su uso en congelados)
Rojo betabel
Silicato de aluminio
Silicato de aluminio y calcio
Silicato de aluminio y sodio
Silicato de calcio
Silicato de magnesio
Sulfato ácido de sodio
Sulfato de calcio
Sulfato de magnesio
Sulfato de potasio
Sulfato de sodio
APENDICE NORMATIVO B.
METODOS DE PRUEBA
B.1. DETERMINACION DE CAFEINA EN BEBIDAS NO ALCOHOLICAS.
B.1.1 Principio del método.
La cafeína es extraída de la muestra con cloroformo y determinada espectrométricamente a una longitud de onda de 276 nm.
B.1.2 Equipo.
B.1.2.1 Espectrómetro de UV-Visible disponible para utilizarse a 276 nm.
B.1.2.2 Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg.
B.1.3 Materiales.
B 1.3.1 Matraces volumétricos de 100 mL.
B 1.3.2 Probetas de 100 mL.
B 1.3.3 Vasos de precipitados de 250 mL.
B 1.3.4 Embudos de separación de 125 mL.
B 1.3.5 Pipetas graduadas de 1 y 10 mL.
B 1.4 Reactivos.
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se entiende agua destilada.
B 1.4.1 Sulfito de sodio anhidro (Na2SO3)
B 1.4.2 Tiocianato de potasio (KSCN).
B 1.4.3 Acido fosfórico (H3PO4).
B 1.4.4 Hidróxido de sodio (NaOH).
B 1.4.5 Cloroformo (CHCl3).
B 1.4.6 Cafeína (C8H10N4O2)
B 1.4.7 Permanganato de potasio (KMnO4).
B 1.4.8 Solución reductora.
Disolver 5 g de Na2SO3 y 5 g de KSCN en agua y llevar a un volumen de 100 mL.
B 1.4.9 Solución diluida de ácido fosfórico.
Diluir 15 mL de H3PO4 con 85 mL de agua.
B 1.4.10 Solución de hidróxido de sodio.
Disolver 25 g de NaOH en 75 mL de agua.
B 1.4.11 Solución patrón de cafeína de 1 mg/mL.
Disolver exactamente 100 mg de cafeína en cloroformo y llevar a un volumen de 100 mL con el mismo solvente.
B 1.4.12 Solución de permanganato de potasio al 1,5%.
Pesar 1,5 g de KMnO4 y disolver en 100 mL de agua.
B 1.5 Procedimiento.
B 1.5.1 Preparación de la curva patrón.
B 1.5.1.1 Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de cafeína, de acuerdo con la Tabla número 1 y llevar a un volumen de 100 mL con cloroformo.
Tabla No. 1
| Matraz
| mL solución patrón de cafeína
| mg cafeína/100 mL
|
| 1
| 0,00
| Blanco
|
| 2
| 0,10
| 0,10
|
| 3
| 0,25
| 0,25
|
| 4
| 0,50
| 0,50
|
| 5
| 1,00
| 1,00
|
| 6
| 1,50
| 1,50
|
| 7
| 2,00
| 2,00
|
B 1.5.1.2 Determinar la absorbancia de cada una de las soluciones patrón a 276 nm.
B 1.5.1.3 Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones patrón en función de su concentración (en mg/100mL). Ajustar la curva mediante regresión lineal (método de mínimos cuadrados). Lo anterior, puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente en los cuales sólo es necesario leer los estándares y marcar su concentración teórica.
B 1.5.2 Preparación de la muestra.
B 1.5.2.1 Eliminar el gas de la muestra por agitación o con ultrasonido.
B 1.5.2.2 Medir 10 mL de muestra en un embudo de separación de 125 mL, adicionar 5 mL de solución de permanganato de potasio al 1,5% y mezclar.
B 1.5.2.3 Después de exactamente 5 minutos, añadir 10 mL de la solución reductora y mezclar.
B 1.5.2.4 Adicionar 1 mL de solución diluida de ácido fosfórico, mezclar, añadir 1 mL de solución de hidróxido de sodio y mezclar.
B 1.5.2.5 Extraer con 50 mL de cloroformo durante un minuto. Dejar separar las fases y drenar la fase inferior filtrando a través de papel filtro. Colectar en un matraz volumétrico de 100 mL.
B 1.5.2.6 Añadir de 2-3 mL de cloroformo al embudo de separación y drenar a través del papel.
B 1.5.2.7 Lavar el papel con 2-3 mL de cloroformo. Extraer nuevamente con 40 mL de cloroformo filtrando y lavando el papel filtro como se describió anteriormente y diluir al volumen con cloroformo.
B 1.5.2.8 Determinar la absorbancia a 270 nm.
B 1.6 Cálculos
De la ecuación de la recta obtenida.
y = mx + b
Donde:
y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada.
m = Pendiente (coeficiente de absortividad).
x = mg cafeína/100 mL en la muestra.
b = Ordenada al origen.
Despejar "x" y obtener directamente los mg de cafeína/100 mL de bebida.
mg cafeína/100 mL = mg de cafeína/100 mL obtenidos de la curva X 100 X F.D.
10
Donde:
F.D. = Factor de dilución.
B 1.7 Expresión de resultados.
B 2 DETERMINACION DE MATERIA EXTRAÑA.
B 2.1 Principio del método.
La materia extraña se separa de la muestra mediante flotación o sedimentación de acuerdo a la naturaleza del producto y posteriormente se filtra para su identificación al microscopio.
B 2.2 Equipo.
B 2.2.1 Balanza granataria con una precisión de 0.1 g.
B 2.2.2 Equipo de filtración al vacío.
B 2.2.3 Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100X, respectivamente.
B 2.2.4 Lámpara para el microscopio o luz natural equivalente.
B 2.2.5 Parrilla de calentamiento con agitación magnética.
B 2.3 Materiales.
B 2.3.1 Matraz trampa de Wildman, formado por un matraz Erlenmeyer de 1 o 2 L, provisto de una varilla metálica con un tapón de émbolo de hule en un extremo.
B 2.3.2 Embudo de Hirsch o Buchner para filtración al vacío.
B 2.3.3 Caja de Petri.
B 2.3.4 Papel de filtración rápida del número 8 rayado para conteo o rayado a lápiz con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
B 2.3.5 Aguja de disección.
B 2.3.6 Material de uso común en el laboratorio.
B 2.4 Reactivos.
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se entiende agua destilada.
B 2.4.1 Heptano (C7H16).
B 2.4.2 Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza.
B 2.4.3 Aceite mineral. Aceite de parafina, blanco y ligero. Con un peso específico de 0,840-0,860 (24 ºC).
B 2.4.4 Glicerina (C3H8O3)
B 2.4.5 Mezcla de glicerina: etanol 1:3 (v/v).
B 2.4.6 Mezclar un volumen de glicerina con 3 volúmenes de etanol.
B 2.5 Procedimiento.
B 2.5.1 Determinación de materia extraña en bebidas no alcohólicas embotelladas o en lata.
B 2.5.1.1 Homogeneizar bien la muestra y filtrar 250 mL sobre un embudo de succión, preparado con papel filtro para conteo, tratando de verterlo uniformemente.
B 2.5.1.2 Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri, y humedecerla con la mezcla de glicerina/ etanol (opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los detalles en el papel filtro.
B 2.5.1.3 Contar explorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea, y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan.
B 2.5.2 Determinación de materia extraña en concentrados y jarabes.
B 2.5.2.1 Homogeneizar bien la muestra. En el caso de concentrados y jarabes reconstituir la muestra siguiendo las instrucciones de la etiqueta.
B 2.5.2.2 En un matraz trampa de Wildman medir 250 mL de muestra, adicionar 15 mL de aceite mineral y agregar agitando vigorosamente suficiente cantidad de agua caliente (70 ºC), hasta que la capa de aceite llegue al cuello del matraz. Dejar reposar 30 minutos.
B 2.5.2.3 Girar suavemente la varilla de metal, para atrapar la capa de aceite, levantándolo e introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello del matraz.
B 2.5.2.4 Mantener el émbolo en su lugar y decantar el líquido que está sobre él a un embudo de succión preparado con un filtro para conteo, tratando de verterlo uniformemente.
B 2.5.2.5 Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri, y humedecerla con la mezcla de glicerinaetanol (opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los detalles en el papel filtro.
B 2.5.2.6 Contar explorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea, y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan.
B 2.5.2.7 En caso de que la muestra contenga tejidos de frutas emplear el siguiente procedimiento:
B 2.5.2.7.1 Pesar en un vaso 100 g de la muestra y adicionar 200 mL de agua caliente (Aprox. a 50 ºC). Transferir al matraz trampa, adicionar 10 mL de ácido clorhídrico y hervir por 3 minutos.
B 2.5.2.7.2 Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 25 mL de heptano y agitar perfectamente. Bajar la varilla de metal y el tapón émbolo de hule, añadir el agua necesaria para que la capa de heptano suba al cuello del matraz.
B 2.5.2.7.3 Dejar reposar por 15 minutos. Girar suavemente la varilla de metal, para remover el sedimento fino que se acumuló en la superficie del tapón émbolo.
B 2.5.2.7.4 Atrapar la capa de heptano levantándolo e introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello del matraz. Mantener el émbolo en su lugar y decantar el líquido que está sobre él a un embudo de succión preparado con un papel filtro para conteo, tratando de verterlo vigorosamente.
B 2.5.2.7.5 Añadir nuevamente 25 mL de heptano al matraz trampa para hacer una segunda extracción heptano sobre el embudo de succión, lavar la varilla y el cuello del matraz con heptano y verterlo sobre el mismo embudo.
B 2.5.2.7.6 Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los detalles en el papel filtro. Contar explorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea, voletear y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan. No contar material dudoso.
B 2.5.3 Determinación de materia extraña en polvos para preparar bebidas.
B 2.5.3.1 Homogeneizar la muestra. Pesar en un vaso 50 g de muestra y adicionar de 400-500 mL de agua agitar bien hasta que toda la muestra se disuelva y aplicar el mismo procedimiento seguido en B 2.5.1
B 2.6 Expresión de resultados.
| Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos de roedor, excretas o cualquier materia extraña encontrada en 50 g, 100 g o 250 mL de producto, según corresponda. |
B 3 DETERMINACION DE QUININA EN BEBIDAS CARBONATADAS.
B 3.1 Principio del método.
La quinina es determinada espectrométricamente en medio ácido a una longitud de onda de 347.5 nm.
B 3.2 Equipo.
B 3.2.1 Espectrómetro de UV-Visible disponible para utilizarse a 347.5 nm.
B 3.2.2 Balanza analítica con una precisión de 0.1 mg.
B 3.2.3 Agitador magnético.
B 3.3 Materiales.
B 3.3.1 Matraces volumétricos de 100 mL.
B 3.3.2 Probetas de 100 mL.
B 3.3.3 Vasos de precipitados de 250 mL.
B 3.4 Reactivos.
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se entiende agua destilada.
B 3.4.1 Quinina (C20H24N2O2). Secada a 100 ºC durante 3 horas.
B 3.4.2 Acido clorhídrico concentrado (HCl).
B 3.4.3 Solución de ácido clorhídrico 0,5 N.
B 3.4.4 Solución patrón de quinina de 1 mg/mL. Pesar exactamente 100 mg de quinina en un matraz volumétrico de 100 mL. Adicionar 20 mL de ácido clorhídrico 0,5 N y llevar al volumen con agua. Mezclar.
B 3.5 Procedimiento.
B 3.5.1 Preparación de la curva patrón.
B 3.5.1.1 Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de quinina, de acuerdo con la Tabla No. 2, en matraces volumétricos de 100 mL.
Tabla No.2
| Matraz
| mL solución patrón de quinina
| mg quinina/L
|
| 1
| 0,00
| Blanco
|
| 2
| 0,50
| 5,0
|
| 3
| 1,00
| 10,0
|
| 4
| 2,00
| 20,0
|
| 5
| 3,00
| 30,0
|
| 6
| 4,00
| 40,0
|
| 7
| 5,00
| 50,0
|
| 8
| 6,00
| 60,0
|
B 3.5.1.2 Adicionar a cada matraz 20 mL de ácido clorhídrico 0.5 N. Llevar al volumen con agua y mezclar.
B 3.5.1.3 Determinar la absorbancia de cada las soluciones patrón a 347,5 nm.
B 3.5.1.4 Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones estándar en función de su concentración (en mg/L). Ajustar la curva mediante regresión lineal (método de mínimos cuadrados). Lo anterior, puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario leer los estándares y marcar su concentración teórica.
B 3.5.2 Preparación de la muestra.
B 3.5.2.1 Vaciar el contenido de la botella o lata en un vaso de precipitados. Agitar magnéticamente hasta eliminar el gas.
B 3.5.2.2 Medir 50 mL de la muestra degasificada en un matraz volumétrico de 100 mL y adicionar 20 mL de ácido clorhídrico 0,5 N y llevar al volumen con agua. Mezclar.
B 3.5.2.3 Determinar la absorbancia a 347,5 nm.
B 3.6 Cálculos.
De la ecuación de la recta obtenida.
y = mx + b
Donde:
y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada.
m = Pendiente (coeficiente de absortividad).
x = mg quinina/L en la muestra.
b = Ordenada al origen.
Despejar "x" y obtener directamente de la curva los mg de quinina/L.
Para obtener la cantidad de quinina en la muestra aplicar la siguiente ecuación:
mg quinina/L = mg quinina/L obtenidos de la curva estándar X 100 X F.D. 50
Donde:
F.D. = Factor de dilución.
B 3.7 Expresión de resultados.
B 4 DETERMINACION DE SULFITOS EN ALIMENTOS. METODO OPTIMIZADO DE MONIER-WILLIAMS.
B 4.1 Principio del método.
El método mide sulfitos libres más porciones reproducibles de sulfitos ligados, tales como productos carbonílicos, en alimentos. La muestra es calentada con ácido clorhídrico (HCl) en reflujo para convertir el sulfato a SO2 (sulfitos). El nitrógeno introducido a la solución arrastra el SO2 a través del condensador enfriado por agua y pasa a una solución del H2O2 al 3% donde el SO2 se oxida a ácido sulfúrico (H2SO4). El contenido de sulfito es directamente relacionado al H2SO4 generado, el cual es determinado por titulación con hidróxido de sodio (NaOH) estandarizado.
Aplicable para la determinación de ³ 10 ppm de sulfitos en alimentos. Aplicable en presencia de otros compuestos volátiles de azufre, no aplicable a cebollas secas, puerros y calabazas.
B 4.2 Equipo.
B 4.2.1 Aparato de Destilación (nota: En este método la presión dentro del aparato está limitada a la presión propia de la solución de H2O2 al 3% encima del extremo del burbujeador, mantener la presión baja para evitar la pérdida del SO2 a través del goteo). Usar una película delgada de vaselina en las superficies que sellan en todas las juntas, excepto en la junta entre el matraz y el embudo de separación. Poner pinza en cada junta para asegurar que sellen completamente.
B 4.2.2 Ensamblar el aparato según se muestra en la figura siguiente:
B 4.2.3 Bureta de 10 mL con tubo de sobrellenado y conexiones para tubo Ascarita o el equivalente para permitir mantener una atmósfera libre de CO2 sobre el hidróxido de sodio 0,01N estandarizado.
B 4.3 Reactivos.
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se entiende agua desionizada.
B 4.3.1 Acido clorhídrico (HCl) acuoso 4N. Para cada análisis, preparar 90 mL de esta solución mezclando 30 mL de HCl y 60 mL de agua desionizada.
B 4.3.2 Indicador de rojo de metilo. Disolver 250 mg de rojo de metilo en 100 mL de etanol.
B 4.3.3 Titulante estandarizado. Hidróxido de sodio (NaOH) 0,010N Estandarizar la solución con estándar de ftalato ácido de potasio.
B 4.3.4 Solución de peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2). Para cada análisis, diluir 3 mL de H2O2 al 30% con 30 mL de agua desionizada. Justo antes de usarse, agregar 3 gotas de indicador de rojo de metilo y titular con hidróxido de sodio (NaOH) 0,010N a un punto final amarillo, si el punto final excedió, descartar la solución.
B 4.3.5 Nitrógeno de alta pureza. Usar un regulador para mantener el flujo de 200 mL/min. Para evitar oxígeno en el nitrógeno se usa una trampa tipo cromatografía de gases.
B 4.4 Preparación de la muestra.
B 4.4.1 Sólidos.
Transferir 50g de alimento o la cantidad que contenga de 500 a 1500 mg de SO2, a un procesador de alimentos o licuadora. Agregar 100 mL de etanol - agua (5+95 v/v) y mezclar. Licuar sólo hasta que el alimento pueda pasar por la junta 24/40 del matraz.
B 4.4.2 Líquidos.
Mezclar 50g de muestra, o la cantidad que contenga de 500 a 1500 mg de SO2 con 100 mL de la mezcla etanol â agua.
Nota: Llevar a cabo la preparación de la muestra y el análisis tan rápido como sea posible para evitar la pérdida de formas lábiles de sulfito.
B 4.5 Preparación del sistema.
B 4.5.1 Usando el aparato ensamblado y el matraz puesto en la manta de calentamiento, agregar 400 mL de agua al matraz.
B 4.5.2 Cerrar la llave del embudo de separación y agregar 90 mL de HCl 4N.
B 4.5.3 Empezar con el flujo de nitrógeno. Iniciar el flujo en el refrigerante.
B 4.5.4 Colocar el recipiente con 30 mL de H2O2, el cual ha sido titulado a punto final amarillo con NaOH 0,010N.
B 4.5.5 Después de 15 min, el aparato y el agua estarán completamente desoxigenadas y la porción de muestras debe ser introducida al sistema.
B 4.5.6 Remover el embudo de separación y cuantitativamente transferir la muestra al matraz.
B 4.5.7 Limpiar la junta y rápidamente aplicar grasa de silicón y regresarlo a su lugar.
B 4.5.8 El flujo de nitrógeno a través de la solución de H2O2 al 3% se reanuda tan pronto como se coloca el embudo en la junta del matraz. Examinar cada junta para asegurar que esté sellado. Usar un bulbo con válvula para aplicar presión sobre el HCl. Abrir la llave y dejar pasar el HCl al matraz. Continuar sosteniendo la válvula para mantener la suficiente presión sobre la solución de ácido para forzarla a pasar. Cerrar la llave antes de que los últimos 2-3 mL drenen para evitar que el SO2 escape hacia el embudo de separación.
B 4.5.9 Calentar la manta al calentamiento y regular para calentar lo suficiente, obteniendo de 80 a 90 gotas/min del condensador.
B 4.5.10 Dejar 1 h 45 min y remover el vaso.
B 4.6 Procedimiento
Inmediatamente titular el contenido del vaso o probeta con hidróxido de sodio 0,010N a punto final amarillo y que persista ³ 20 segundos.
B 4.7 Cálculos.
Calcular el contenido de sulfitos, como sigue:
| mg SO2,/g =
| 32,03 x VB x N x 1000
|
| peso de muestra
|
Donde:
32,03 = peso milequivalente del SO2
VB = Volumen (ML) del NaOH
N = Normalidad del NaOH
1000 = Factor para convertir milequivalentes a microequivalentes
Peso de muestra: cantidad de muestra que se introdujo al matraz
B 5 DETERMINACION DE SULFITOS POR GRAVIMETRIA (OPCIONAL).
B 5.1 Después de la titulación, llevar el contenido del recipiente a un vaso de 400 mL agregar 4 gotas de HCl 1N y un exceso de solución de BaCl2 al 10% y dejar reposar toda la noche.
B 5.2 Lavar el precipitado por decantación 3 veces con agua caliente a través de un Gooch previamente pesado. Lavar con 20 mL de alcohol etílico y 20 mL de éter y secar a 105 °-110 °C.
B 5.3 Determinar el blanco de reactivos para la titulación y para el método gravimétrico y considerarlo en el cálculo de los resultados.
B 5.4 Preparación del Aparato de Filtración
B 5.4.1 Unir el receptáculo con un filtro de fibra de vidrio.
B 5.4.2 Colocar lo anterior en el matraz kitasato.
B 5.4.3 Lavar el filtro con 10 mL de agua caliente, desionizada y después con 10 mL de etanol usando vacío.
B 5.4.4 Quitar el filtro y secarlo a 110 °C durante 12 horas o más. Transferir a desecador para enfriar a temperatura ambiente. Pesar (Wb).
B 5.4.5 Colocar el filtro en el receptáculo de vidrio.
B 5.5 Precipitado de BaSO4
B 5.5.1 Pasar el precipitado por el filtro. Lavar con agua para asegurar que todo ha sido filtrado.
B 5.5.2 Pasar 10 mL de etanol a través del precipitado y filtrar con vacío.
B 5.5.3 Remover el filtro y secar en estufa a 110 °C durante toda la noche.
B 5.5.4 Transferir a desecador, enfriar y pesar (Wp).
B 5.6 Cálculos.
Calcular el contenido de sulfitos como sigue:
| mg SO2,/g =
| [(Wp â Wb) x 274,46]
|
| g muestra
|
Donde:
Wp = Peso de papel filtro con el precipitado de BaSO4 a peso constante
Wb = Peso de papel filtro preparado y puesto a peso constante
B 5.7 Ensayos de Recuperación.
B 5.7.1 Para familiarizarse y eficientizar el método antes de realizar la rutina, analizar porciones de muestra que contengan cantidades conocidas de sulfitos.
B 5.7.2 Realizar los análisis de manera que se omita cualquier pérdida de sulfitos por oxidación o reacción con los componentes en el alimento.
B 5.7.3 Debido a que los sulfitos son reactivos con el aire y con algunas matrices alimenticias y dado que carecen de estabilidad, se debe fortificar con fuentes estables de sulfitos, no sulfito de sodio o sales similares.
B 5.7.4 El hidroximetil sulfonato de sodio (HMS), el cual es estructuralmente similar a algunas formas combinadas de sulfitos en alimentos, es útil para preparar porciones de prueba fortificada.
B 5.7.5 Para el análisis, transferir 50g de muestra de alimento libre de sulfitos al matraz. Agregar una alicuota de solución de la sal sódica de hidroximetil sulfonato. Analizar inmediatamente.
B 5.7.6 Recuperaciones de > 80% del HMS con matrices alimenticias de 10 ppm son recomendables para asegurar una adecuada exactitud analítica.
B 5.8 Informe de las pruebas.
B 6 DETERMINACION DE SODIO (Na) POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA CON ADITAMENTO DE FLAMA
B 6.1 Fundamento
La muestra se somete a una digestión ácida con ácido nítrico concentrado para que el analito liberado sea cuantificado por espectrofotometría de absorción atómica.
B 6.2 Reactivos
B 6.2.1 Acido nítrico (HNO3) concentrado grado suprapuro
B 6.2.2 Acido nítrico (HNO3) concentrado G.R.
B 6.2.3 Estándar certificado de Na de 1000 mg/mL
B 6.2.4 Agua deionizada
B 6.3 Materiales
B 6.3.1 Sistema de reflujo
B 6.3.2 Material común de laboratorio
B 6.3.3 Papel filtro No. 1
B 6.4 Equipo
B 6.4.1 Balanza analítica con una sensibilidad de 0.1 mg
B 6.4.2 Espectrofotómetro de absorción atómica con aditamento de flama
B 6.4.3 Parrilla de calentamiento
B 6.4.4 Lámpara de cátodo hueco de sodio
B 6.5 Preparación de la muestra para ensayo
B 6.5.1 Productos sólidos
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.
B 6.5.2 Productos líquidos
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio o de plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4 °C). Mezclar bien antes del uso.
B 6.5.3 Descontaminación del material
En una cubeta de polietileno (volumen aproximado de 15L) introducir 10L de mezcla ácido nítrico/agua (1:1). En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada. Secar.
B 6.6 Procedimiento
B 6.6.1 Se pesa de 1,0 a 2,0 g de muestra en un matraz de fondo plano de 250 mL con boca esmerilada, se le añaden 10 mL de HNO3 grado suprapuro y se digieren por calentamiento en un sistema de reflujo durante 2 h o hasta digestión completa.
B 6.6.2 La muestra se enfría y se filtra a través de papel filtro No. 1 y se recibe en un matraz aforado de 100 mL.
B 6.6.3 Se lava tres veces el matraz de la digestión con tres porciones de 10 mL de agua deionizada y los lavados se filtran y se reciben en el matraz aforado, se lleva a volumen con agua deionizada.
B 6.6.4 Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las recomendaciones del fabricante usando un estándar certificado.
B 6.6.5 Se leen las muestras y se anotan los resultados obtenidos en mg/mL, de acuerdo a lo siguiente:
B 6.6.5.1 Longitud de onda: 589,6 nm
B 6.6.5.2 Llama: aire-acetileno, oxidante
Nota: Se recomienda meter una muestra añadida para valorarla y hacer un blanco de reactivos para cada serie de digestiones.
B 6.6.6 Cálculo
En donde:
A = mg/mL de Na+ en la muestra
B = mg/mL de Na+ en el blanco
C = mL de aforo de la muestra
D = peso de la muestra en g tomada para el análisis
B 6.6.6.1 Sensibilidad del método: 0,15 mg/mL para 1% de absorción.
B 7 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS OBJETO DE ESTA NORMA
B 7.1 Procedimiento para la preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
B 7.1.1 Fundamento
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
B 7.1.2 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.
B 7.1.2.1 Preparación de reactivos
B 7.1.2.1.1 Solución de hidróxido de sodio 1,0 N
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Hidróxido de sodio | 4,0 g
|
| Agua | 100 mL
|
Preparación:
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 mL con agua.
B 7.1.2.1.2 Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Fosfato de sodio monobásico | 34,0 g
|
| Agua | 1,0 L
|
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
Llevar a un litro con agua.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ° ± 1,0 °C.
Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilizar a 121 ° ± 1,0 °C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
B 7.1.2.1.3 Agua peptonada
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Peptona | 1,0 g
|
| Cloruro de sodio | 8,5 g
|
| Agua | 1,0 L
|
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1,0 °C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5 °C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
B 7.1.3 Materiales
B 7.1.3.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
B 7.1.3.2 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.
B 7.1.3.3 Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
B 7.1.3.4 Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
B 7.1.3.5 Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse mediante: Horno, durante 2 h a 170 a 175 °C o 1 h a 180 °C o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0 °C.
B 7.1.3.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
B 7.1.4 Aparatos e instrumentos
B 7.1.4.1 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 °C.
B 7.1.4.2 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
B 7.1.4.3 Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5 °C.
B 7.1.4.4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
B 7.1.4.5 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
B 7.1.4.6 Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
B 7.1.5 Procedimiento
B 7.1.5.1 Preparación de la dilución primaria.
B 7.1.5.1.1 Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45 °C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
B 7.1.5.1.2 Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total.
B 7.1.5.1.2.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
B 7.1.5.1.2.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente
B 7.1.5.1.3 A partir de muestras sólidas o semisólidas.
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8 ºC durante 8 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis.
B 7.1.5.1.3.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.
B 7.1.5.1.3.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.
B 7.1.5.1.3.3 Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.
B 7.1.5.1.3.4 Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensión.
B 7.1.5.1.3.5 Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.
B 7.1.5.1.3.6 El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
B 7.1.5.2 Preparación de las diluciones decimales adicionales.
B 7.1.5.2.1 Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
B 7.1.5.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe en el punto B 7.1.5.1.
B 7.1.5.2.3 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
B 7.1.5.2.4 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
B 7.1.5.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido.
B 7.1.5.2.6 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.
B 7.1.5.2.7 En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.
B 7.1.5.2.8 El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es:
B 7.1.5.2.8.1 Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 mL de la dilución más alta.
B 7.1.5.2.8.2 Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.
B 7.1.6 Duración del procedimiento.
En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación.
B 7.2 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
B 7.2.1 Fundamento
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
B 7.2.2 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico.
Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad.
B 7.2.3 Medios de Cultivo.
B 7.2.3.1 Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de levadura | 2,5 g
|
| Triptona | 5,0 g
|
| Dextrosa | 1,0 g
|
| Agar | 15,0 g
|
| Agua | 1,0 L
|
Preparación del medio de cultivo.
Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución.
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 mL, cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1,0 ºC, durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25 ºC.
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45 ºC ± 1,0 ºC en baño de agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de una vez.
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.
El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en particular se requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento.
B 7.2.4 Materiales
Todo el material que tenga contacto con las muestras o los microorganismos debe estar estéril. Se requiere, los materiales mencionados en el apartado B 7.1
B 7.2.5 Aparatos e instrumentos
Se requiere, además de los mencionados en B.7.1, los siguientes:
B 7.2.5.1 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0 ºC, provista con termómetro calibrado.
B 7.2.5.2 Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
B 7.2.5.3 Registrador mecánico o electrónico.
B 7.2.5.4 Microscopio óptico.
B 7.2.5.5 Baño de agua con o sin circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de hasta 1,0 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0 °C.
B 7.2.6 Preparación de la muestra
Para la preparación de la muestra seguir el numeral B 7.1.
B 7.2.7 Procedimiento
B 7.2.7.1 Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.
B 7.2.7.2 Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según en B 7.1 en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
B 7.2.7.3 Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
B 7.2.7.4 El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
B 7.2.7.5 Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase el cuadro 1.
CUADRO 1
| Grupo bacteriano
| Temperatura
| Tiempo de incubación
|
| Termofílicos aerobios | 55 ± 2 ºC
| 48 ± 2 h
|
| Mesofílicos aerobios | 35 ± 2 ºC
| 48 ± 2 h
|
| Psicrotróficos | 20 ± 2 ºC
| 3 - 5 días
|
| Psicrofílicos | 5 ± 2 ºC
| 7 - 10 días
|
B 7.2.7.6 En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta.
B 7.2.7.7 Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento.
B 7.2.8 Cálculos del método.
B 7.2.8.1 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el cuadro 2, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.
B 7.2.8.2 Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2.
B 7.2.8.3 Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes guías:
B 7.2.8.4 Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 3.
B 7.2.8.5 Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 4.
B 7.2.8.6 Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas:
B 7.2.8.6.1 Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias.
B 7.2.8.6.2 Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.
B 7.2.8.6.3 Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar.
B 7.2.8.6.4 Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de la caja.
B 7.2.8.6.5 Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están incluidas en el numeral B 7.2.8.6.4, contar cualquiera de los demás tipos especificados en el numeral B 7.2.8.6.4, como provenientes de una sola fuente.
B 7.2.8.6.6 En el caso de las colonias de las que se habla en el primer guion, del numeral B 7.2.8.6.1, si la caja contiene una sola cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena individualmente.
B 7.2.8.6.7 Las colonias mencionadas en el primer y tercer guion, generalmente se observan como crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos mencionados en el cuarto apartado, reportarlos como crecimiento extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y otra dilución presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden contar las colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5
B 7.2.8.7 Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada, véase el cuadro 2, ejemplo 6.
B 7.2.8.8 Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para determinar la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 7.
B 7.2.8.9 Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 8.
B 7.2.8.10 Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 9.
B 7.2.8.11 Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400).
B 7.2.9 Informe de la prueba
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___ UFC/g o mL, de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas ________ horas a _______ ºC.
CUADRO 2
Cálculo de los valores de la cuenta en placa (ensayos por duplicado)
| Ejemplo
| | Colonias contadas
| | UFC/g o mL
|
| Número
| 1:100
| 1:1,000
| 1:10,000
| |
| 1
| >250
| 178
| 16
| 180,000
|
| | >250
| 190
| 17
| |
| 2
| >250
| 220
| 25
| 250,000
|
| 3
| 18
| 2
| 0
| 1,600
|
| | 14
| 0
| 0
| |
| 4
| >250
| >250
| 512
| 5,000,000
|
| | >250
| >250
| 495
| |
| 5
| >250
| 235
| Crecimiento extendido
| |
| 6
| 0
| 0
| 0
| <100
|
| 7
| >250
| 240
| 24
| 250,000
|
| | >250
| 268
| 19
| |
| 8
| >250
| 216
| 23
| 280,000
|
| | >250
| 262
| 42
| |
| 9
| >250
| 215
| 20
| 23,000
|
| | >250
| 235
| 26
| |
| | >250
| 275
| 32
| 270,000
|
| | >250
| 225
| 26
| |
B 7.3 Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
B 7.3.1 Fundamento
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35 °C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
B 7.3.2 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.
B 7.3.2.1 Soluciones diluyentes
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Fosfato monopotásico | 34,0 g
|
| Agua | 1,0 l
|
Preparación
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
Llevar con agua a un litro.
Esterilizar a 121 ± 1,0 °C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
Agua peptonada
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Peptona | 1,0
|
| NaCl | 8,5 g
|
| Agua | 1,0 l
|
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5 °C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
B 7.3.2.2 Medio de cultivo
Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Peptona | 7,0 g
|
| Extracto de levadura | 3,0 g
|
| Lactosa | 10,0 g
|
| Sales biliares | 1,5 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Rojo neutro | 0,03 g
|
| Cristal violeta | 0,002 g
|
| Agar | 15,0 g
|
| Agua | 1,0 l
|
Preparación:
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25 °C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor.
Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45 °C.
Evitar el sobrecalentamiento del medio.
No debe esterilizarse en autoclave.
Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.
En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.
B 7.3.3 Materiales
B 7.3.3.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de algodón.
B 7.3.3.2 Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
B 7.3.3.3 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.
B 7.3.3.4 Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.
B 7.3.3.5 Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
B 7.3.3.6 Cajas Petri.
B 7.3.3.7 Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
B 7.3.3.8 Horno, durante 2 h a 170 - 175 °C, o 1 h a 180 °C; o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0 °C.
B 7.3.3.9 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte.
B 7.3.4 Aparatos e instrumentos
B 7.3.4.1 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 °C.
B 7.3.4.2 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
B 7.3.4.3 Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0 °C.
B 7.3.4.4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
B 7.3.4.5 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
B 7.3.4.6 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0 °C, provista con termómetro calibrado.
B 7.3.4.7 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
B 7.3.4.8 Registrador mecánico o electrónico.
B 7.3.4.9 Microscopio óptico.
B 7.3.4.10 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
B 7.3.5 Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la sección B 7.1 "Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico."
B 7.3.6 Procedimiento
B 7.3.6.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
B 7.3.6.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
B 7.3.6.3 Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0 °C en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
B 7.3.6.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.
B 7.3.6.5 Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad.
B 7.3.6.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 mL del medio RVBA a 45 ± 1,0 °C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.
B 7.3.6.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35 °C, durante 24 ± 2 horas.
B 7.3.6.8 Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.
B 7.3.6.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.
B 7.3.7 Cálculos del método
B 7.3.7.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características.
Separar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los criterios del punto B 7.2.8.1 "Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa."
B 7.3.7.2 Placas que contienen menos de 15 colonias características.
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido de la dilución correspondiente.
B 7.3.7.3 Placas con colonias no características.
Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.
B 7.3.8 Informe de la prueba
Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 °C durante 24 ± 2h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por mL".
B 7.4 Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.
B 7.4.1 Fundamento
La presente técnica para la detección de Salmonella spp. en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
B 7.4.1.1 Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella spp. dañadas a una condición fisiológica estable.
B 7.4.1.2 Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella spp. e inhibir otros organismos presentes en la muestra.
B 7.4.1.3 Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella spp. y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.
B 7.4.1.4 Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella spp. y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.
B 7.4.1.5 Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.
B 7.4.2 Reactivos
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.
B 7.4.2.1 Medios de pre-enriquecimiento
B 7.4.2.1.1 Agua de peptona tamponada
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Peptona | 10,0 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Fosfato sódico dibásico | 3,5 g
|
| Fosfato potásico monobásico | 1,5 g
|
| Agua | 1,0 L
|
Preparación
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a 7,0.
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba.
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1 ºC.
B 7.4.2.1.2 Caldo lactosado
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de carne | 3,0 g
|
| Peptona | 5,0 g
|
| Lactosa | 5,0 g
|
| Agua destilada | 1,0 g
|
| pH final 6,9 + 0,2
|
Preparación
Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65 ºC.
Distribuir en porciones de 225 mL, en frascos de 500 mL.
Esterilizar durante 15 min a 121 ºC ± 1 ºC.
B 7.4.2.2 Medios de enriquecimiento
B 7.4.2.2.1 Caldo selenito-cistina
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Tristona o polipeptona
| 5,0 g
|
| Lactosa
| 4,0 g
|
| Fosfato disódico
| 10,0 g
|
| Selenito ácido de sodio
| 4,0 g
|
| L- cistina
| 0,01 g
|
| Agua destilada
| 1,0 l
|
| pH final 7,0 + 2 a 25 °C
| |
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en recipientes estériles, según se requiera.
El caldo así preparado es transparente. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación.
Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110 ºC ± 1 ºC, tomando entonces un color salmón.
B 7.4.2.2.2 Caldo tetrationato
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Proteosa peptona o triptona | 5,0 g
|
| Sales biliares | 1,0 g
|
| Carbonato de calcio | 10,0 g
|
| Tiosulfato de sodio pentahidratado | 30,0
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final 7,0 + 0,1
|
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril.
Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10 y 225 mL, en recipientes estériles. Guardar en refrigeración.
Antes de usar el medio, agregar 2 mL de una solución yodo-yoduro y 1 mL de solución de verde brillante al 0,1% por cada 100 mL de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo día de su preparación.
B 7.4.2.2.3 Vassiliadis-Rappaport
| Solución A
|
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Tristona | 5,0 g
|
| Cloruro de sodio | 8,0 g
|
| Fosfato de potasio hidrogenado | 1,6 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70 ºC.
| Solución B
|
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Cloruro de magnesio hexahidratado | 400 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
Disolver el cloruro de magnesio en agua.
Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/mL.
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.
| Solución C
|
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Oxalato de verde de malaquita | 0,4 g
|
| Agua destilada | 100 mL
|
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.
| Medio completo
|
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Solución A | 1,000 mL
|
| Solución B | 100 mL
|
| Solución C | 10 mL
|
Preparación
Adicionar 1 000 mL de la solución A, 100 mL de la solución B y 10 mL de la solución C.
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5,2.
Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantidades de 10 mL.
Almacenar en refrigeración.
B 7.4.2.2.4 Caldo de soya tripticasa
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Tripticasa o triptosa | 17,0 g
|
| Fitona | 3,0 g
|
| Glucosa | 2,5 g
|
| Cloruro de sodio | 2,5 g
|
| Agua destilada | 1,0 g
|
| pH final 7,3 + 0,2 |
Preparación
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa.
Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 ºC ± 1 ºC.
B 7.4.2.2.5 Leche descremada reconstituida
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en matraces Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar a 121 ºC ± 1 ºC por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 mL.
B 7.4.2.2.6 Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 mL de medio, quedando una concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adicionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en autoclave en la forma habitual.
B 7.4.2.3 Medios de aislamiento
B 7.4.2.3.1 Agar verde brillante (VB)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de levadura | 3,0 g
|
| Polipeptona (proteosa peptona N ° 3) | 10,0 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Lactosa | 10,0 g
|
| Sacarosa | 10,0 g
|
| Rojo de fenol | 0,08 g
|
| Agar | 20,0 g
|
| Verde brillante | 0,0125 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final 6,9 ± 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. Ajustar el pH.
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ºC ± 1 ºC. El sobrecalentamiento del medio disminuye su selectividad.
Enfriar el medio a 50 ºC y distribuirlo en cajas de Petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, de color marrón.
B 7.4.2.3.2 Agar con sulfito de bismuto
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de carne de res | 5,0 g
|
| Mezcla de peptonas | 10,0 g
|
| Glucosa | 5,0 g
|
| Fosfato disódico (anhidro) | 5,0 g
|
| Sulfato ferroso (anhidro) | 0,3 g
|
| Sulfito de bismuto | 8,0 g
|
| Verde brillante | 0,025 g
|
| Agar | 20,0 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final | 7,6 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH.
Enfriar a 45 ºC y verter en cajas de Petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del medio.
El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la coloración es parda, no deben utilizarse.
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad.
B 7.4.2.3.3 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Xilosa | 3,75 g
|
| L- lisina | 5,0 g
|
| lactosa | 7,5 g
|
| Sacarosa | 7,5 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Extracto de levadura | 3,0 g
|
| Rojo de fenol | 0,08 g
|
| Agar | 15,0 g
|
| Desoxocolato de sodio | 2,5 g
|
| Citrato férrico- amónico | 0,8 g
|
| Tiosulfato de sodio | 6,8 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final | 6,9 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 55 ºC, agitando frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH.
Enfriar a 50 ºC y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice.
El sobrecalentamiento produce una precipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñas.
El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante.
B 7.4.2.3.4 Agar para Salmonella y Shigella (SS)
| Extracto de carne | 5,0 g
|
| Polipeptona | 5,0 g
|
| Lactosa | 10,0 g
|
| Sales biliares | 8,5 g
|
| Citrato de sodio dihidratado | 8,5 g
|
| Tiosulfato de sodio pentahidratado | 8,5 g
|
| Citrato férrico | 1,0 g
|
| Agar | 13,5 g
|
| Rojo neutro | 0,025 g
|
| Verde brillante | 0,33 mg
|
| Agua destilada | 1,0 L
|
| pH final 7,0 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición hasta disolución completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave.
Enfriar a 50 ºC y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.
El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.
B 7.4.2.3.5 Agar entérico Hektoen
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Proteosa peptona | 12, 0 g
|
| Extracto de levadura | 3,0 g
|
| Lactosa | 12,0 g
|
| Sacarosa | 12,0 g
|
| Salicilina | 2,0 g
|
| Sales biliares | 9,0 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Tiosulfato de sodio | 5,0 g
|
| Citrato amónico férrico | 1,5 g
|
| Azul de bromotimol | 0,064 g
|
| Fascina ácida | 0,1 g
|
| Agar | 13,5 g
|
| Agua | 1,0 L
|
| pH final | 7,5 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa disolución del agar.
No sobrecalentar.
Dejar enfriar a 55-60 ºC y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.
B 7.4.2.4 Medios para pruebas bioquímicas
B 7.4.2.4.1 Agar de tres azúcares y hierro (TSI)
| Peptona de carne | 1,0 g
|
| Paptona de caseína | 1,0 g
|
| Cloruro de sodio | 0,5 g
|
| Lactosa | 1,0 g
|
| Sacarosa | 1,0 g
|
| Glucosa | 0,1 g
|
| Agar | 1,3 g
|
| Rojo de fenol | 2,5 mg
|
| Sulfato ferroso amónico pentahidratado | 20,0 mg
|
| Tiosulfato de sodio | 20,0 mg
|
| Agua destilada | 100 mL
|
| pH final 7,3 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en 100 mL de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, hasta disolución completa.
Enfriar a 60 ºC y ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min.
Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.
B 7.4.2.4.2 Agar de hierro y lisina (LIA)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Peptona de gelatina | 0,5 g
|
| Extracto de levadura | 0,3 g
|
| Glucosa | 0,1 g
|
| L-lisina | 1,0 g
|
| Citrato férrico amónico | 50 mg
|
| Tiosulfato de sodio anhidro | 4,0 mg
|
| Púrpura de bromocresol | 2,0 mg
|
| Agar | 1,5 g
|
| Agua destilada | 100 mL
|
| pH final | 6,7 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca.
Esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm.
El medio ya preparado es de color púrpura.
B 7.4.2.4.3 Agar nutritivo
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de carne | 3,0 g
|
| Peptona | 5,0 g
|
| Agar | 15,0 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final | 6,8 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min.
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su volumen.
Esterilizar a 121 ºC ± 1 ºC por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique.
B 7.4.2.4.4 Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de carne | 3,0 g
|
| Peptona | 30,0 g
|
| Hierro peptonizado | 0,20 g
|
| Tiosulfato de sodio | 0,025 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final | 7,3 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una disolución completa.
Enfriar a 50 ºC y ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en posición vertical.
B 7.4.2.4.5 Agar citrato de Simmons
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Fosfato de amonio | 1,0 g
|
| Fosfato dipotásico | 1,0 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Citrato de sodio | 2,0 g
|
| Sulfato de magnesio | 0,20 g
|
| Azul de bromotimol | 0,08 g
|
| Agar | 15,0 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final | 6,8 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una disolución completa.
Ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min.
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada.
B 7.4.2.4.6 Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
| Peptona | 7,0 g
|
| Dextrosa | 5,0 g
|
| Difosfato de potasio | 5,0 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final | 6,9 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una disolución completa.
Ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min.
B 7.4.2.4.7 Caldo manitol
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de carne | 1,0 g
|
| Proteosa peptona | 10,0 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Rojo de fenol | 0,018 g
|
| Manitol | 10,0 g
|
| Agua | 1,0 l
|
| pH final | 7,4 + 0,2
|
Preparación
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 mL en tubos de 13 x 100 mm.
Esterilizar a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min.
B 7.4.2.4.8 Caldo malonato
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Extracto de levadura | 1,0 g
|
| Sulfato de amonio | 2,0 g
|
| Fosfato dipotásico | 0,6 g
|
| Fosfato monopotásico | 0,6 g
|
| Cloruro de sodio | 2,0 g
|
| Malonato | 3,0 g
|
| Glucosa | 0,250 g
|
| Azul de bromotimol | 0,025 g
|
| Agua | 1,0 l
|
| pH final | 6,7 + 0,2
|
Preparación
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH.
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 mL.
Esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min.
B 7.4.2.4.9 Caldo urea
| Urea | 20,0 g
|
| Extracto de levadura | 0,1 g
|
| Fosfato monopotásico | 9,10 g
|
| Fosfato dipotásico | 9,5 g
|
| Rojo de fenol | 0,01 g
|
| Agua | 1,0 l
|
| pH final | 6,8 + 0,2
|
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de presión durante 15 min.
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm.
B 7.4.2.4.10 Caldo de urea rápido
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Urea | 20, 0 g
|
| Extracto de levadura | 0,10 g
|
| Fosfato monopotásico | 0,091 g
|
| Fosfato dipotásico | 0,095 g
|
| Rojo de fenol | 0,010 g
|
| Agua | 1,0 l
|
| pH final | 6,8 + 0,2
|
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm.
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm.
B 7.4.2.4.11 Caldo infusión cerebro corazón
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Infusión cerebro corazón | 200,0 g
|
| Infusión de corazón de res | 250,0 g
|
| Proteosa peptona | 10,0 g
|
| Cloruro de sodio | 5,0 g
|
| Fosfato disódico dodecahidratado | 2,5 g
|
| Dextrosa | 2,0 g
|
| Agua destilada | 1,0 l
|
| pH final | 7,4 ± 0,2
|
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente.
Distribuir y esterilizar a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min.
B 7.4.2.5 Soluciones
B 7.4.2.5.1 Solución verde brillante al 0,1% (1:1000)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Verde brillante | 0,1 g
|
| Agua destilada estéril | 100,0 mL
|
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada estéril hasta completar 100 mL.
B 7.4.2.5.2 Solución de yodo-yoduro
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Cristales de yodo | 6,0 g
|
| Yoduro de potasio | 6,0 g
|
| Agua destilada | 100,0 mL
|
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 mL.
Conservar en frasco ámbar.
B 7.4.2.5.3 Solución salina al 0,85%
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Cloruro de sodio | 0,85 g
|
| Agua destilada | 100,0 mL
|
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min.
B 7.4.2.5.4 Solución salina formalizada
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Solución de formaldehído (36-38%) | 6,0 mL
|
| Cloruro de sodio | 8,5 g
|
| Agua destilada | 1,0 L
|
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min.
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 mL de la solución de formaldehído. No esterilizar después de la adición de formaldehído.
B 7.4.2.5.5 Reactivo de Kovac
| Ingredientes
| Cantidades
|
| p-dimetil-aminobenzaldehído | 5,0 g
|
| Alcohol amílico | 75,0 mL
|
| Acido clorhídrico concentrado | 25,0 mL
|
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol amílico y después agregar el ácido clorhídrico lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración.
B 7.4.2.5.6 Solución de alfa-naftol al 5%
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Alfa-naftol | 5,0 g
|
| Alcohol | 100,0 mL
|
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 mL.
B 7.4.2.5.7 Solución de rojo de metilo
| Rojo de metilo | 0,10 g
|
| Alcohol etílico | 300,0 mL
|
| Agua destilada c.b.p. | 500,0 mL
|
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL.
B 7.4.2.5.8 Solución de hidróxido de potasio al 40%
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Hidróxido de potasio | 40,0 g
|
| Agua destilada | 100,0 mL
|
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 mL.
B 7.4.2.5.9 Solución de gelatinasa al 5%
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Gelatinasa | 5,0 g
|
| Agua | 100,0 mL
|
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 mL de agua destilada. NO CALENTAR.
B 7.4.2.6 Antisueros
B 7.4.2.6.1 Antisuero polivalente somático (O)
B 7.4.2.6.2 Antisuero polivalente flagelar (H)
B 7.4.2.6.3 Antisuero Vi
B.7.4.3 Material
B 7.4.3.1 Matraces Erlenmeyer de 500 mL
B 7.4.3.2 Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y compuestas
B 7.4.3.3 Angulos de vidrio
B 7.4.3.4 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas
B 7.4.3.5 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm
B 7.4.3.6 Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm
B 7.4.3.7 Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 mL, graduadas en 0,1 mL y protegidas con tapón de algodón
B 7.4.3.8 Pipetas de 1 mL, con graduaciones de 0,01 mL
B 7.4.3.9 Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables
B 7.4.3.10 Rejillas para tubos de ensaye
B 7.4.3.11 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro
B 7.4.3.12 Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color
B 7.4.3.13 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
B 7.4.3.14 Horno, durante 2 horas a 170-175 ºC o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121 ºC ± 1 ºC
B 7.4.4 Equipo
B 7.4.4.1 Horno para esterilizar que alcance los 180 ºC
B 7.4.4.2 Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1 ºC y termómetro
B 7.4.4.3 Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas
B 7.4.4.4 Baño María con termostato y termómetro
B 7.4.4.5 Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g
B 7.4.4.6 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o aluminio)
B 7.4.4.7 Mecheros Bunsen o Fisher
B 7.4.4.8 Potenciómetro
B.7.4.5 Procedimiento
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se recomienda una muestra de 25 g o más.
B 7.4.5.1 Procedimiento general para la preparación de muestras
B 7.4.5.1.1 Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 mL del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min.
B 7.4.5.1.2 Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 ± 2 h a 35 ºC. Continuar como se indica en el punto i) del numeral 7.4.5.2
B 7.4.5.2 Aislamiento de Salmonella
B 7.4.5.2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.
B 7.4.5.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35 ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42 ºC por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.
B 7.4.5.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. Incubar las placas 24 ± 2 h a 35 ºC.
B 7.4.5.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:
B 7.4.5.2.5 Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
B 7.4.5.2.6 Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
B 7.4.5.2.7 Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
B 7.4.5.2.8 Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.
B 7.4.5.2.9 Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.
B 7.4.5.3 Identificación bioquímica
B 7.4.5.3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35 ºC. Almacenar en refrigeración de 5 a 8 ºC las placas con medios selectivos por si es necesario retomar más colonias. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:
B 7.4.5.3.2 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.
B 7.4.5.3.3 Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella spp. producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.
B 7.4.5.3.4 Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en el punto B.7.4.5.3.5.
B 7.4.5.3.5 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios.
B 7.4.5.3.6 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.
B 7.4.5.3.7 Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
B 7.4.5.3.8 Prueba de ureasa
B 7.4.5.3.8.1 Prueba de ureasa (convencional).
Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35 ºC.
B 7.4.5.3.8.2 Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5 ºC en baño de agua.
B 7.4.5.3.8.3 Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio).
B 7.4.5.4. Identificación serológica
B 7.4.5.4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)
B 7.4.5.4.1.1 Colocar con una asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.
B 7.4.5.4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
B 7.4.5.4.1.3 Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.
B 7.4.5.4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina. Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.
B 7.4.5.4.1.5 Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes).
B 7.4.5.4.1.6 Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.
B 7.4.5.4.1.7 Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública.
B 7.4.5.4.2 Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).
B 7.4.5.4.2.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35 ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseína e incubar por 24 ± 2 h a 35 ºC (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 mL de solución salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).
B 7.4.5.4.2.2 Colocar 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13
x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50 ºC. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
B 7.4.5.5 Pruebas bioquímicas complementarias
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación. Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:
B 7.4.5.5.1 Agar citrato Simmons
Inocular por estría el tubo.
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2 ºC.
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
B 7.4.5.5.2 Medio SIM
Inocular por punción.
Incubar 24 h a 35 ± 2 ºC.
B 7.4.5.5.2.1 Movilidad.
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.
B 7.4.5.5.2.2 Producción de ácido sulfihídrico.
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.
Prueba negativa: ausencia de color negro.
B 7.4.5.5.2.3 Producción de indol
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac.
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
B 7.4.5.5.3 Caldo RM-VP
Inocular un tubo con el medio.
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2 ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.
B 7.4.5.5.3.1 Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Transferir a un tubo un mL del cultivo de 48 h.
Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol.
Adicionar 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%.
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2 ºC o 4 h a temperatura ambiente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2 ºC.
B 7.4.5.5.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM)
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.
Interpretar los resultados inmediatamente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo.
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.
B 7.4.5.5.4 Caldo malonato
Inocular un tubo conteniendo el medio.
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2 ºC.
Prueba positiva: desarrollo de color azul.
Prueba negativa: sin cambio de color.
B 7.4.5.5.5 Caldo manitol
Inocular un tubo conteniendo el medio.
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2 ºC.
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
B 7.4.5.5.6 Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las bacterias investigadas.
Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las pruebas bioquímicas convencionales.
B 7.4.6 Cálculo y expresión de resultados
B 7.4.6.1 Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas.
CUADRO 1
| Reacciones bioquímicas
| Reacciones serológicas
| Interpretación
|
| Típica
| Antígeno O, Vi o H positivo
| Cepas consideradas como
Salmonella spp.
|
| Típica
| Todas las reacciones negativas
|
| Típica
| No probada
| Puede ser Salmonella
|
| Reacciones atípicas
| Antígeno O, Vi o H positivo
|
| Reacciones atípicas
| Todas las reacciones negativas
| No debe ser considerada
Salmonella
|
Nota: ver figura 1
CUADRO 2
| Prueba o sustrato
| Positivo
| Negativo
| Reacción
|
| Glucosa (TSI)
| Amarillo
| Rojo
| +
|
| Lisina descarboxilasa (LIA)
| Púrpura
| Amarillo
| +
|
| H2S (TSI y LIA)
| Negro
| No negro
| +
|
| Ureasa
| Rojo-púrpura
| No hay cambio de color
| -
|
| Caldo de lisina descarboxilasa
| Púrpura
| Amarillo
| +
|
| Caldo dulcitol rojo de fenol
| Amarillo o gas
| No hay cambio de color ni gas
| + b
|
| Caldo KCN
| Crecimiento
| No hay crecimiento
| -
|
| Caldo malonato
| Azul
| No hay cambio de color
| - c
|
| Prueba de indol
| Superficie color violeta
| Superficie color amarillo
| -
|
| Prueba del antígeno flagelar
| Aglutinación
| No hay aglutinación
| +
|
| Prueba del antígeno somático
| Aglutinación
| No hay aglutinación
| +
|
| Caldo lactosa rojo fenol
| Amarillo o gas
| No hay cambio de color ni gas
| - c
|
| Caldo sacarosa rojo fenol
| Amarillo o gas
| No hay cambio de color ni gas
| -
|
| Prueba Voges-Proskauer
| De rosa a rojo
| No hay cambio de color
| -
|
| Prueba rojo de metilo
| Rojo difuso
| Amarillo difuso
| +
|
| Citrato de Simmons
| Crecimiento color azul
| No hay crecimiento, no hay
cambio de color
| v
|
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días; v, variable.
b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos.
c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos.
B 7.4.6.2 Informe de resultados
Informar: presencia o ausencia de Salmonella spp. en __________ g o ____________ mL de muestra.
B 7.5 Determinación de bacterias coliformes.
Técnica del número más probable
B 7.5.1 Fundamento
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1 °C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación.
B 7.5.2 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad.
B 7.5.2.1 Soluciones diluyentes
B 7.5.2.1.1 Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Fosfato monopotásico | 34,0 g
|
| Agua | 1,0 l
|
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N.
Llevar a un litro con agua.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1 °C.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
B 7.5.2.1.2 Agua peptonada
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Peptona | 1,0 g
|
| Cloruro de sodio | 8,5 g
|
| Agua | 1,0 l
|
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5 °C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
B 7.5.2.2 Medios de cultivo.
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo).
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo).
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación).
En el caso del análisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo.
B 7.5.2.2.1 Caldo lactosado
CUADRO 1
| Ingredientes
| Medio de concentración
1,5
| Medio de concentración
sencilla
|
| Extracto de carne | 4,5 g
| 3,5 g
|
| Peptona de gelatina | 7,5 g
| 5,0 g
|
| Lactosa | 7,5 g
| 5,0 g
|
| Agua destilada | 1000 mL
| 1000 mL
|
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25 °C.
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación.
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Enfriar rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige.
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL del caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.
B 7.5.2.2.2 Caldo lauril sulfato triptosa.
CUADRO 2
| Ingredientes
| Medio de concentración 1,5
| Medio de concentración
sencilla
|
| Triptosa | 30 g
| 20 g
|
| Lactosa | 7,5 g
| 5,0 g
|
| Fosfato dipotásico | 4,125 g
| 2,75 g
|
| Fosfato monopotásico | 4,125 g
| 2,75 g
|
| Cloruro de sodio | 7,5 g
| 5,0 g
|
| Laurel sulfato de sodio | 0,15 g
| 0,1 g
|
| Agua destilada | 1000 mL
| 1000 mL
|
Disolver los componentes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25 °C.
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación.
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado.
Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire después de la esterilización.
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra.
B 7.5.2.2.3 Caldo lactosa bilis verde brillante
| Ingredientes
| Cantidades
|
| Peptona | 10,0 g
|
| Lactosa | 10,0 g
|
| Sales biliares | 20,0 g
|
| Verde brillante | 0,013 g
|
| Agua | 1,0 L
|
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25 °C.
Distribuir el medio en cantidades de 10 mL en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.
B 7.5.2.3 Materiales
B 7.5.2.3.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de algodón.
B 7.5.2.3.2 Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
B 7.5.2.3.3 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.
B 7.5.2.3.4 Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
B 7.5.2.3.5 Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca.
B 7.5.2.3.6 Campanas de fermentación (tubos de Durham).
B 7.5.2.3.7 Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 mL.
B 7.5.2.3.8 Gradillas.
B 7.5.2.3.9 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro.
B 7.5.2.3.10 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
B 7.5.2.3.11 Horno, durante 2 horas a 170 a 175 °C o 1 h a 180 °C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0 °C.
B 7.5.2.3.12 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte.
B 7.5.2.4 Aparatos e instrumentos
B 7.5.2.4.1 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 °C.
B 7.5.2.4.2 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0 °C, provista con termómetro calibrado.
B 7.5.2.4.3 Termómetro de máximas y mínimas.
B 7.5.2.4.4 Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0 °C.
B 7.5.2.4.5 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
B 7.5.2.5 Preparación de la muestra
Seguir el procedimiento como lo indica el punto B.7.1 "Procedimiento para la preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológicos".
B 7.5.2.6 Procedimiento
B 7.5.2.6.1 Para agua potable y hielo
B 7.5.2.6.1.1 Prueba presuntiva
B 7.5.2.6.1.1.1 Inoculación. Agitar la muestra. Transferir volúmenes de 10 mL de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 mL de caldo lactosado de mayor concentración y 1,0 mL y 0,1 mL de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 mL de caldo lactosado de concentración sencilla o caldo laurel sulfato triptosa con púrpura de bromocresol.
B 7.5.2.6.1.1.2 Incubación. Incubar los tubos a 35 °C. Examinar a las 24 ± 2 h y observar si hay formación de gas o la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 h.
B 7.5.2.6.1.2 Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación, caldo lactosa lauril bilis verde brillante. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 horas.
En esta Norma Oficial Mexicana, para el análisis de agua potable, agua purificada así como hielo, se emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 mL, 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL, véase el cuadro 4.
B 7.5.2.6.2 Para sólidos.
Preparar suficiente número de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la última dilución rindan un resultado negativo.
B 7.5.2.6.2.1 Prueba presuntiva
B 7.5.2.6.2.1.1 Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida o 10 mL de la dilución primaria inicial, en el caso de otros productos.
B 7.5.2.6.2.1.2 Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida o 1 mL de la dilución primaria en el caso de otros productos.
B 7.5.2.6.2.1.3 Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el párrafo anterior, usando una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio.
B 7.5.2.6.2.1.4 Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas.
B 7.5.2.6.2.2 Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas.
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisión en los resultados, será necesario inocular una serie de cinco o diez tubos.
B 7.5.2.7 Expresión de los resultados
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.
B 7.5.2.7.1 El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar.
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las diluciones mayores posteriores.
B 7.5.2.7.2 Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elegir esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.
B 7.5.2.7.3 Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más de tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.
B 7.5.2.7.4 Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 mL o 1 g) y en la primera dilución (1 mL o 10-1 g), seleccionar las tres primeras diluciones para el cálculo del número más probable. En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado en los cuadros 4 al 7, según corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP. La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta técnica deben ser utilizados con precaución. Los límites de confianza están representados en los cuadros 4 al 7. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los límites de confianza en el 95% de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2 cuadro 3).
CUADRO 4. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados
positivos cuando son usados varios números de tubos.
(Diluciones 10, 1,0 y 0,1 g)
| Combinación de
positivos
| Indice del
NMP por g
| 3 tubos por dilución 95%
límites de confianza
| 5 tubos por
dilución
Indice del
NMP por g
| 95% límites de confianza
|
| bajo
| alto
| bajo
| alto
|
| 0-0-0
| <0,03
| <0,005
| <0,09
| <0,02
| <0,005
| <0,07
|
| 0-0-1
| 0,03
| <0,005
| <0,09
| 0,02
| <0,005
| 0,07
|
| 0-1-0
| 0,03
| <0,005
| 0,13
| 0,02
| <0,005
| 0,07
|
| 0-2-0
| --
| --
| --
| 0,04
| <0,005
| 0,11
|
| 1-0-0
| 0,04
| <0,005
| 0,20
| 0,02
| <0,005
| 0,07
|
| 1-0-1
| 0,07
| 0,01
| 0,21
| 0,04
| <0,005
| 0,11
|
| 1-1-0
| 0,07
| 0,01
| 0,23
| 0,04
| <0,005
| 0,11
|
| 1-1-1
| 0,11
| 0,03
| 0,36
| 0,06
| <0,005
| 0,15
|
| 1-2-0
| 0,11
| 0,03
| 0,36
| 0,06
| <0,005
| 0,15
|
| 2-0-0
| 0,09
| 0,01
| 0,36
| 0,05
| <0,005
| 0,13
|
| 2-0-1
| 0,14
| 0,03
| 0,37
| 0,07
| 0,01
| 0,13
|
| 2-1-0
| 0,15
| 0,03
| 0,44
| 0,07
| 0,01
| 0,17
|
| 2-1-1
| 0,20
| 0,07
| 0,89
| 0,09
| 0,02
| 0,17
|
| 2-2-0
| 0,21
| 0,04
| 0,47
| 0,09
| 0,02
| 0,21
|
| 2-2-1
| 0,28
| 0,10
| |
