NORMA Oficial Mexicana NOM-131-SSA1-2012, Productos y servicios NORMA Oficial Mexicana NOM-131-SSA1-2012, Productos y servicios. Fórmulas para lactantes, de continuación y para necesidades especiales de nutrición. Alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños de corta edad. Disposiciones y especificaciones sanitarias y nutrimentales. Etiquetado y métodos de prueba (Continúa de la Cuarta Sección)
(Viene de la Cuarta Sección)
B.7.2.2 Materiales
§ Mecheros de Bunsen o Fischer.
§ Abrelatas sanitarios.
§ Pinzas, espátulas y cucharas.
§ Charolas.
§ Pipetas serológicas de 10 ml con tapón de algodón.
§ Pipetas despuntadas o tubos de 8 mm de diámetro con tapón de algodón.
§ Propipeta o bulbo para pipeta.
§ Tubos de cultivo de 18 x 150 o de 22 x 175 mm.
§ Embudos grandes de tallo corto.
§ Portaobjetos.
§ Cajas de Petri estériles.
§ Punzón para latas.
§ Asa de platino o nicromel en porta-asas.
§ Cepillo para lavar las latas.
§ Toallas o gasas estériles.
§ Solución de yodo al 4% (en etanol al 70%).
§ Sistema de anaerobiosis.
§ Varillas de vidrio de 20 cm de longitud y 3 mm de grueso, dobladas en ángulo recto de 5 cm en uno de sus extremos.
§ Azul de metileno, cristal violeta o equipo para tinción de Gram.
B.7.3 Aparatos e instrumentos
§ Autoclave con termómetro o manómetro.
§ Horno para esterilizar a 180 °C.
§ Incubadoras con termómetro y termostato que evite variaciones > de 0,1 °C.
§ Potenciómetro de escala expandida.
§ Microscopio compuesto.
B.7.4 Preparación de las muestras
B.7.4.1 Llevar un registro en el laboratorio en donde se anoten:
B.7.4.1.1 El número de lote (o señalar si éste no existe o está incompleto)
B.7.4.1.2 Todos los datos importantes para la identificación del producto que aparezcan en la etiqueta; identificar la muestra en forma indeleble, antes de remover la etiqueta. Conservar el envase y la etiqueta.
B.7.4.1.3 Los defectos físicos que se observen en el envase como abolladuras, golpes que lo deformen, oxidación, derrames, defectos aparentes de las cerraduras, abombamiento, etcétera.
Según su apariencia externa clasificarlas como sigue:
B.7.4.2 Latas
B.7.4.2.1 Latas planas o normales.
B.7.4.2.2 Abombamiento ligero (Flipper), Grado I. Unicamente uno de los extremos de la lata se encuentra
ligeramente abombado, pero puede comprimirse fácilmente.
B.7.4.2.3 Abombamiento elástico (Springer), Grado II. Uno de los extremos se encuentra abombado; al presionarle el extremo opuesto se abulta.
B.7.4.2.4 Hinchazón (Soft swell), Grado III. Ambos extremos se encuentran abombados, pero pueden comprimirse o ceden ligeramente a la presión.
B.7.4.2.5 Hinchazón (Hard swell), Grado IV. Ambos extremos se encuentran abombados y no pueden comprimirse: la lata puede reventar.
B.7.4.3 Frascos de vidrio
B.7.4.3.1 Tapa normal
B.7.4.3.2 Tapa abombada
B.7.4.4 Incubación de los envases
B.7.4.4.1 Incubación de productos en envases de apariencia normal.
La prueba más confiable para determinar la esterilidad comercial es la incubación del producto a temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre pueda desarrollarse bajo las condiciones del producto envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el envase o en el producto. Incubar de 30 a 35 °C por 10 a 14 días.
Observar diariamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en diferentes grados y en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la formación de burbujas. En cuanto se detecte hinchazón en el producto o cualquier otra desviación suspender la incubación.
Al final del periodo de incubación, abrir las latas para descubrir descomposición ácida (flat sour), por cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimento. Preparar extensiones, teñirlas con azul de metileno o tinción de Gram y observarlas microscópicamente. El hallazgo de cualquier anormalidad indica que el producto no está comercialmente estéril y se debe proceder como para los envases alterados.
B.7.4.4.2 Incubación de envases sospechosos o alterados
Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas que no presenten alteración evidente o con abombamiento de grado I de 30 a 35 °C por 10 a 14 días.
Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse. Aquellas que se clasifiquen como grado III o IV de no analizarse en el momento, deberán refrigerarse.
B.7.4.5 Apertura de las latas o envases
B.7.4.5.1 Area de trabajo
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente ultra-limpio, clase 100 (el equipo debe proveer un ambiente libre de partículas de 0,3 micras con una eficiencia del 99,99% en un flujo de 100 pies 3/min). La desinfección de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o sales cuaternarias de amonio a la concentración recomendada por el fabricante. Posteriormente se debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes de efectuar el trabajo.
Para controlar la eficacia del flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los lados y al centro del área de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operación.
Si no se tiene el equipo necesario, se puede utilizar un cuarto o cubículo perfectamente limpio, lavado con agua y jabón, desinfectándolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajará entre dos mecheros Bunsen.
B.7.4.5.2 Personal
El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe usar turbante. El uso de mascarillas quirúrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema infeccioso no debe intervenir en el análisis.
B.7.4.6 Preparación de latas o envases normales
Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabón; enjuagar y dejar secar.
Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde está grabado el lote. Escurrir el líquido y secar con la flama de un mechero.
Destapar con un abridor de latas sanitario estéril.
En las latas de cierre de anillo o dispositivos abre fácil, abrir por la cara opuesta.
B.7.4.6.1 Frascos de vidrio
Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solución sanitizante, de manera que quede cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100 mg/kg. Colocar un algodón estéril en torno a la tapa y con un punzón estéril hacer un orificio en el centro, a fin de que se pierda el vacío y pueda abrirse con facilidad. Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo.
B.7.4.7 Preparación de latas o envases alterados
Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jabón; enjuagar y secar. Si la lata está muy inflada, mantener en el refrigerador antes de abrirla. Limpiar y sanitizar la tapa con una solución de cloro 100 mg/kg o yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gasa estéril.
En latas muy infladas de pH muy ácido, es necesario hacer una prueba para hidrógeno, con objeto de conocer si el gas se debe a la acción del ácido sobre el metal.
Para ello, practicar una pequeña puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. Una pequeña explosión indica la presencia de hidrógeno. No debe flamearse directamente el orificio de la lata.
Para abrir latas infladas, colocar un embudo invertido con un algodón estéril sobre la tapa y picar con un picahielo estéril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata.
B.7.5 Procedimiento
Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical. Tomar porciones tanto del contenido sólido como del líquido; si es posible, homogeneizar. Utilizando utensilios adecuados a la naturaleza del producto (espátulas, pinzas, tubos de vidrio, pipetas, etcétera) transferir aproximadamente 2 g o 2 ml del producto a los tubos con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento.
Conservar una muestra en un frasco estéril, para cualquier aclaración o para efectuar pruebas biológicas. Hacer una extensión en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los gérmenes causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y sólo el examen microscópico puede dar una idea de los microorganismos involucrados en la descomposición. Preparar las extensiones mediante un asa de platino. Si el alimento es sólido o muy espeso, agregar una pequeña cantidad de agua estéril. Si es muy grasoso, depositar sobre la extensión una pequeña cantidad de xilol con posterioridad a su fijación por calor.
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento: su olor, cambios en su color, consistencia, etcétera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata. Observar su interior, anotando el estado del barniz, la presencia de manchas, defectos del frasco o de la tapa, etcétera.
B.7.5.1 Examen de alimentos envasados de baja acidez (pH > 4,6)
Inocular aproximadamente 2 g o 2 ml, en cada uno de 4 tubos con caldo hígado, previamente calentado a 100 °C para expulsar el oxígeno disuelto, y enfriar rápidamente.
Inocular asimismo, 4 tubos de caldo púrpura de bromocresol.
Incubar según el siguiente esquema:
| MEDIO DE CULTIVO
| TUBOS
| TEMPERATURA
| TIEMPO
| INVESTIGACION
|
| Caldo hígado o CCC | 2 | 35 °C | 96 h/120 h | Mesofílicos anaerobios |
| Caldo hígado o CCC | 2 | 55 °C | 24 h/72 h | Termofílicos anaerobios |
| Caldo púrpura de bromocresol | 2 | 35 °C | 96 h/120 h | Mesofílicos aerobios |
| Caldo púrpura de bromocresol | 2 | 55 °C | 24 h/48 h | Termofílicos aerobios |
Transferir los alimentos líquidos por medio de una pipeta, utilizando un bulbo o propipeta. ¡Precaución! Tener cuidado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases aparentemente normales. ¡La Toxina botulínica puede estar presente! Observar los tubos diariamente, hasta el término del tiempo de
incubación si no hay crecimiento en todos los tubos, descartar e informar como NEGATIVO.
Cuadro 1
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS DE
BAJA ACIDEZ (> 4,6)
| CULTIVO
ORIGINAL
| TEMPERATURA
| SUBCULTIVO
| | CULTIVO
PURO
| IDENTIFICACIÓN
|
| CH o CCC y CGPB | 35 °C 96/120 h | AN o AHT Aeróbico AN o AHT Anaeróbico | Crecimiento Crecimiento | Frotis CH o CCC Frotis CH o CCC | Tinción de Gram Anaeróbico AN o AHT Tinción de Gram Aeróbico AN o AHT |
| CH o CCC y CGPB | 55 °C 24/72 h | AN o AHT Aeróbico AN o AHT Anaeróbico | Crecimiento Crecimiento | Frotis CH o CCC Frotis CH o CCC | Tinción de Gram Anaeróbico Tinción de Gram Aeróbico AN o AHT |
CH = Caldo Hígado de Ternera AN = Agar Nutritivo
CCC = Caldo Carne Cocida AHT = Agar Hígado de Ternera
CGPB = Caldo Púrpura de Bromocresol
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS ACIDOS (> 4,6)
| CULTIVO
ORIGINAL
| TEMPERATURA
| SUBCULTIVO
| | CULTIVO
PURO
| IDENTIFICACION
|
| CA,CEM | 30 °C 96/120 h | AN, ADS o ADP Aeróbico AN, ADS o ADP Anaeróbico | Crecimiento Crecimiento | Frotis CA, CEM Frotis CA, CEM | Tinción de Gram Anaeróbico AN, ADS o ADP Tinción de Gram Aeróbico AN, ADS o ADP |
| CA | 55 °C 24/72 h | AN Aeróbico AN Anaeróbico | Crecimiento Crecimiento | Frotis CA Frotis CA | Tinción de Gram Anaeróbico AN Tinción de Gram Aeróbico AN |
CA = Caldo Acido AN = Agar Nutritivo
CEM = Caldo Extracto de Malta ADS = Agar Dextrosa Sabouraud
ADP = Agar Papa Dextrosa
Si hay crecimiento, hacer frotis y teñir-resembrar a placas de agar hígado de ternera (sin yema de huevo) o agar nutritivo. Incubar a 35 °C y 55 °C una placa en aerobiosis y anaeróbico (ver cuadro 1) continuar la incubación a 35 °C de caldo de hígado (CH) o caldo carne cocida (CCC) hasta un máximo de 5 días y guardar para determinación de toxina (cuando proceda).
Observar los agares y seleccionar un número representativo de los diferentes tipos de colonias y resembrar a CH y CCC a la temperatura y las condiciones según se especifica en el cuadro 1 (a 35 °C por 96 a 120 h y 55 °C por 24 a 72 h).
Expulsar el oxígeno inmediatamente antes de utilizar el CH que se va a incubar en anaerobiosis. Mantener viables los cultivos puros aislados. Hacer tinción de Gram.
B.7.5.1.1 Cuando se presente crecimiento microbiano durante las pruebas para esterilidad comercial en un enlatado y no haya evidencia de descomposición del alimento, efectuar la confirmación de la siguiente forma:
B.7.5.1.1.1 Obtener cultivos puros de la cepa o cepas encontradas.
B.7.5.1.1.2 Seleccionar otro envase del mismo producto y el mismo lote que el anterior.
B.7.5.1.1.3 En condiciones asépticas, practicar una pequeña perforación en el extremo de la lata o cerca del cierre.
B.7.5.1.1.4 Inocular el producto con la cepa por abajo de la superficie.
B.7.5.1.1.5 Flamear el orificio para crear vacío y sellar asépticamente con soldadura o un material similar.
B.7.5.1.1.6 Después de inocular, incubar a 30 a 35 °C durante 10 días.
B.7.5.1.1.7 Abrir el enlatado y examinar el producto.
El aspecto del producto debe ser igual al que se observó en el envase de donde se obtuvo el cultivo. Si en el primer enlatado el producto fue de apariencia normal, pero se obtuvo crecimiento y en el segundo, inoculado con la flora microbiana aislada del primero, se encuentra el producto alterado (gas, consistencia diferente, olor, etcétera), debe considerarse que el primer enlatado era comercialmente estéril y que el crecimiento fue el resultado de un procedimiento deficiente por el laboratorio. Si se encuentra flora mixta únicamente en el CGPB, hacer informe de los tipos morfológicos. Si hay flora mixta en CH/CCC entre la cual se incluyan bacilos, hacer prueba toxina. Si se observan únicamente bacilos Gram positivo o Gram variable típicos del género Bacillus o Clostridium investigar presencia de esporas. En algunos casos las células vegetativas envejecidas pueden dar la apariencia de Gram negativo y debe considerarse como si fuera Gram positivo. Determinar la presencia de toxina. Esta prueba la podrá realizar un laboratorio oficialmente acreditado por las autoridades correspondientes.
B.7.5.2 Examen microbiológico de alimentos envasados de acidez alta (pH < 4,6)
Inocular 2 g o 2 ml de alimento en 4 tubos de caldo ácido y 2 tubos de caldo extracto de malta.
Incubar según el esquema:
| MEDIO DE CULTIVO
| TUBOS
| TEMPERATURA
| TIEMPO
| INVESTIGACION
|
| Caldo ácido | 2 | 30 °C | 96 h | Lactobacilos, hongos y levaduras |
| Caldo ácido | 2 | 55 °C | 48 h | Termofílicos de descomposición ácida |
| Caldo extracto de malta | 2 | 30 °C | 96 h | Lactobacilos, hongos y levaduras |
B.7.6 Expresión de resultados
B.7.6.1 Envases normales
Conviene extremar los cuidados al efectuar los ensayos, seleccionar las muestras e interpretar los resultados de las pruebas para demostrar la esterilidad comercial, ya que cualquier error basado en fallas de manipulación o interpretación, puede originar la destrucción de un lote comercialmente estéril, como contaminado. Al incubar el enlatado o al recibirse la lata, la presencia de hinchazón, principalmente cuando es muy acentuada, indica contaminación microbiana. Estas condiciones deben ser confirmadas demostrando la presencia de un gran número de microorganismos en las extensiones preparadas directamente a partir del alimento, descubriendo cambios en el aspecto del producto (consistencia, olor, coloración anormal) o variaciones en el pH, en comparación siempre con un producto normal. Los cultivos se practican por duplicado, cuando hay contaminación, en ambos tubos se debe hallar una flora similar a la encontrada en las extensiones de la muestra original. Encontrar sólo uno de los tubos de cultivo positivo y otro negativo, puede indicar una contaminación por manipulación en el laboratorio, a menos que se compruebe que existe el mismo tipo de flora que en la extensión de la muestra original.
A veces existe alguna dificultad en diferenciar partículas del alimento de microorganismos. Otras veces las levaduras o lactobacilos participan en la producción del alimento, como sucede en algunos productos obtenidos por fermentación. En estos casos, aunque ya no sean viables, los microorganismos pueden aparecer en la extensión, y sólo la experiencia y el conocimiento de los procesos permiten interpretar correctamente los resultados.
B.7.6.2 Envases alterados, con pH > 4,6.
B.7.6.2.1 Presencia de mesofílicos aerobios
La flora presente en este caso, puede estar constituida por bacilos o ser mixta.
B.7.6.2.1.1 Presencia de bacilos esporulados
Generalmente consiste en esporas termorresistentes de diferentes especies de bacilos. Regularmente el alimento no presenta alteraciones, ya que las esporas no pueden desarrollarse en condiciones de anaerobiosis; sin embargo, se han encontrado alteraciones producidas por bacilos con esporas resistentes (Bacillus mesentericus y Bacillus subtilis), en alimentos de acidez media, con tratamiento térmico adecuado, pero con vacío incompleto. También se ha encontrado Bacillus nigrificans, en conservas de betabeles con ennegrecimiento del producto.
B.7.6.2.1.2 Presencia de flora mixta
La presencia de flora mixta se debe generalmente a la penetración de gérmenes, con posterioridad al proceso térmico, actuando como vehículo el agua de enfriamiento. La flora que se observa puede ser muy variada.
La penetración de los gérmenes se debe a defectos en las cerraduras, que permiten el paso de los microorganismos. Las latas generalmente se encuentran infladas y pueden mostrar defectos o derrames.
El pH y el aspecto del producto varían.
B.7.6.2.2 Presencia de mesofílicos anaerobios
Consiste de anaerobios del género Clostridium, entre los que se encuentran B. sporogenes, B. putrificans, C. hystoliticum, C. bifermentans, C. perfringens y C. botulinum; este último es el de mayor importancia sanitaria, por producir una toxina muy potente. Las latas pueden estar parcialmente infladas y el producto parcialmente digerido; el olor es pútrido. El pH aumenta. En este caso, es necesario practicar la prueba en animales, tanto del producto como del filtrado del cultivo, para investigar la presencia de la toxina. Esta prueba la podrá realizar un laboratorio oficialmente acreditado por las autoridades correspondientes.
B.7.6.2.3 Presencia de termofílicos aerobios
Consta de bacilos termofílicos estrictos o facultativos, que poseen esporas muy resistentes al calor (especie tipo B. stearothermophilus, causante de la descomposición ácida flat sour). Las latas son planas, sin alteración y con marcado aumento de la acidez del producto; puede haber olor anormal o enturbiamiento del líquido.
B.7.6.2.4 Termofílicos anaerobios
Pertenecen también al género Clostridium, con esporas muy resistentes al calor.
La especie tipo C. thermosaccharolyticum, es un anaerobio estricto no productor de sulfhídrico; las latas se encuentran infladas.
Otro tipo de descomposición poco común, puede ser causada por C. nigrificans, que produce sulfhídrico con ennegrecimiento del producto.
B.7.6.3 Interpretación de resultados en alimentos de acidez alta
B.7.6.3.1 Presencia de mesofílicos aerobios
B.7.6.3.1.1 Presencia de Lactobacillus. La descomposición por bacterias acidúricas no formadoras de esporas, puede deberse a varias especies del género Lactobacillus. Se han aislado L. lycoperci, L. pentoaceticus, L. menitipolum y L. pleofructi.
B.7.6.3.1.2 Presencia de levaduras. El hallazgo de levaduras indica falta de procesamiento. Las latas contaminadas generalmente se presentan muy hinchadas y el olor del producto es característico de levadura (olor ácido). Entre las levaduras se han aislado esporas del género Torula.
B.7.6.3.1.3 Presencia de hongos. Otro tipo de descomposición puede ser causada por hongos como Byssochlamys fulva, que forma esporas muy resistentes al calor. Se han encontrado también algunas cepas de Penicillium; en estos casos generalmente las latas se encuentran planas, sin alteración y el hongo crece en la superficie del producto.
B.7.6.3.2 Mesofílicos anaerobios
Clostridium pasteurianum causa una descomposición poco frecuente, en que las latas se encuentran infladas y con olor butírico. Si se sospecha este tipo de contaminación, sembrar un tubo con medio o caldo ácido en anaerobiosis a 35 °C.
B.7.6.3.3 Termofílicos aerobios
La descomposición por termofílicos aerobios produce el tipo flat-sour, o sea la descomposición ácida. Las latas se encuentran planas y se observan cambios en el vacío; entre los gérmenes causantes está B. coagulans, que es el responsable de la descomposición de productos derivados del jitomate y de la producción de grumos de leche evaporada.
B.7.6.3.4 Termofílicos anaerobios
La descomposición por termofílicos anaerobios es poco frecuente en productos ácidos. La producen anaerobios butíricos.
En productos de acidez muy alta, con pH inferior a 3,7, como col agria, encurtidos, etcétera, la descomposición puede deberse a las bacterias ya señaladas, pero generalmente la acidez inhibe el desarrollo de gérmenes. En muchos casos, la hinchazón de la lata se debe a causas químicas, por formación de hidrógeno.
B.7.6.4 Observaciones generales
Algunas veces se pueden encontrar cultivos negativos, procedentes de latas anormales, o de latas normales con productos descompuestos. Esto puede deberse a que la alteración ocurrió antes del procesamiento térmico del enlatado y han muerto los microorganismos que la originaron, o bien a que en un producto contaminado, los gérmenes murieron al agotarse el oxígeno o los nutrientes.
En estos casos, un examen microscópico del producto puede ayudar al diagnóstico.
METODOS FISICOQUIMICOS
B.8 DETERMINACION DE CADMIO, ARSENICO, PLOMO, ESTAÑO, COBRE, FIERRO, ZINC Y MERCURIO EN ALIMENTOS, AGUA POTABLE Y AGUA PURIFICADA POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA
B.8.1 Fundamento
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia tal que puede ser absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor atómico. La medida de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determinar el porciento de absorción. La cantidad de absorción aumenta con la concentración de los átomos en el medio absorbente, es decir, la medida de la absorción aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que esté en su condición original o sujeta a pretratamiento.
B.8.2 Reactivos y materiales
B.8.2.1 Reactivos
§ Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales.
§ Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25 ºC.
§ Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro.
§ Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo.
§ Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro.
§ Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro.
§ Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro.
§ Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro.
§ Acido nítrico 65% v/v grado RA.
§ Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12).
§ Hidróxido de sodio granalla reactivo RA.
§ Aire comprimido seco y limpio.
§ Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno, grado absorción atómica.
§ Solución de nitrato de magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O en 1000 ml de HCl 1 N.
§ Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 ml de HCl y llevar a 100 ml de agua.
§ Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 ml de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 ml de agua.
§ Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.
§ Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.
§ Solución de yoduro de potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe prepararse en el momento de usarse).
§ Solución de yoduro de potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe prepararse en el momento de usarse).
§ Solución de cloruro de potasio (10 mg/ml de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 ml con agua.
§ Solución de nitrato de magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 ml de agua.
§ Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada deionizada.
§ Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con agua destilada deionizada.
§ Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g de borohidruro de sodio en 100 ml de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío.
§ Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 ml de ácido sulfúrico concentrado con aproximadamente 300 ml de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso en solución. Diluir a 500 ml.
§ Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua destilada deionizada, agregar 58 ml de ácido nítrico concentrado de muy baja concentración de mercurio y 67 ml de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua.
§ Solución de trabajo de As de 1 µg/ml. Diluir 1 ml de la solución patrón de 1000 µg/ml a 1 l con ácido sulfúrico 1 N preparada a partir de la solución grado suprapuro. Preparar fresca cada día.
B.8.2.2 Materiales
§ Matraces Kjeldahl de 500 ml y 800 ml.
§ Sistema de reflujo con refrigerante.
§ Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de capacidad.
§ Crisoles de platino de 40 a 50 ml de capacidad.
§ Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades.
§ Matraces volumétricos de diferentes capacidades.
§ Matraces redondos de fondo plano de 50 ml.
§ Bombas Parr.
§ Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades.
§ Puntas de plástico para micropipetas.
§ Papel filtro Whatman No. 2.
§ Perlas de ebullición.
§ Varillas de plástico.
§ Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 ml.
§ Recipientes de propilen o propileno.
§ Embudos de filtración de diferentes capacidades.
§ Material común de laboratorio.
Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones:
- El jabón que se use debe ser de preferencia neutro.
- Enjuagar perfectamente con agua corriente.
- Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que contenga una solución de ácido nítrico grado RA al 30%.
- Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 h.
- Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada.
- Dejar escurrir y secar.
- Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire.
B.8.3 Aparatos e instrumentos
B.8.3.1 Aparatos
§ Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc.
§ Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga.
§ Automuestreador y recirculador de agua.
§ Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC.
§ Horno de microondas.
§ Autoclave que alcance 121 ± 5 ºC o 15 lb de presión.
§ Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm.
B.8.3.2 Instrumentos
Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su operación.
§ Espectrómetro de absorción atómica equipado con los accesorios para flama, horno de grafito, generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir.
§ Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg.
§ Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10 ºC.
§ Horno de calentamiento (estufa) con intervalo de temperatura de 120 ± 5 ºC.
B.8.4 Preparación de la muestra
B.8.4.1 Digestión para la determinación de Cadmio, Cobre, Hierro, Plomo y Zinc.
B.8.4.1.1 Digestión por vía húmeda.
B.8.4.1.1.1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.
B.8.4.1.1.2 Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la digestión.
B.8.4.1.1.3 Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes.
B.8.4.1.1.4 Calentar suavemente.
B.8.4.1.1.5 Digerir la muestra 3 h o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la adición de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar peróxido de hidrógeno gota a gota con agitación continua (reacción exotérmica).
B.8.4.1.1.6 Enfriar.
B.8.4.1.1.7 Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico.
B.8.4.1.1.8 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.8.4.1.1.9 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica por flama u horno de grafito).
B.8.4.1.2 Digestión por vía seca.
B.8.4.1.2.1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.
B.8.4.1.2.2 Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la digestión. En productos con alta concentración de proteínas adicionar una solución de nitrato de magnesio al 7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a sequedad aproximadamente durante 6 h en estufa a una temperatura de 90 a 95 ºC.
B.8.4.1.2.3 Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4 ºC por minuto hasta 350 °C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos.
B.8.4.1.2.4 Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550 ºC para evitar que la muestra se incinere y mantener esa temperatura durante 16 h o toda la noche.
B.8.4.1.2.5 Apagar la mufla y dejar enfriar.
B.8.4.1.2.6 Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de carbón, mediante el siguiente procedimiento:
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa de calentamiento puesta a 120 ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y elevar la temperatura gradualmente de 500 a 550 ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir este procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente.
B.8.4.1.2.7 Disolver las cenizas completamente en 5 ml de ácido clorhídrico 1 N, transferir la muestra disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 ml de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 ml en el primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partículas o materia insoluble, filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determinación.
B.8.4.1.2.8 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.8.4.1.2.9 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).
B.8.4.2 Digestión por vía húmeda para la determinación de Estaño.
B.8.4.2.1 Proceder igual que en el punto (B.8.4.1.1.1).
B.8.4.2.2 No adicionar ácido nítrico si no se lleva a cabo la digestión total en el mismo día.
B.8.4.2.3 Adicionar 30 ml de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 min en campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma.
B.8.4.2.4 Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 ml o hasta que la muestra empiece a secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine.
B.8.4.2.5 Retirar la muestra del calor.
B.8.4.2.6 Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos.
B.8.4.2.7 Adicionar 25 ml de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante aproximadamente 15 min, hasta que todo el cloro sea liberado. Aumentar la temperatura gradualmente hasta ebullición.
B.8.4.2.8 Evaporar hasta obtener de 10 a 15 ml, usando un matraz similar con 15 ml de agua como patrón de volumen.
B.8.4.2.9 Adicionar aproximadamente 40 ml de agua.
B.8.4.2.10 Agitar y pasar a un matraz de 100 ml y enjuagar con 10 ml de agua.
B.8.4.2.11 Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar toda la noche o por más tiempo.
B.8.4.2.12 Agregar 1 ml de solución de cloruro de potasio en cada matraz.
B.8.4.2.13 Enfriar a temperatura ambiente.
B.8.4.2.14 Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz.
B.8.4.2.15 Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 ml a través de un papel filtro Whatman No. 2 y recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno.
B.8.4.2.16 No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por varios meses.
B.8.4.2.17 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.8.4.2.18 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).
B.8.4.3 Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg.
B.8.4.3.1 Sistema de reflujo.
B.8.4.3.1.1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición.
B.8.4.3.1.2 Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado y calentar durante media hora o hasta que no se observen cambios en la digestión.
B.8.4.3.1.3 Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1).
B.8.4.3.1.4 Calentar y agregar más ácido nítrico gota a gota sobre las paredes del recipiente, hasta que el color obscuro de la solución desaparezca.
B.8.4.3.1.5 Enfriar.
B.8.4.3.1.6 Si existe grasa o cera filtrar la solución.
B.8.4.3.1.7 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.8.4.3.1.8 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).
B.8.4.3.2 Sistema cerrado.
B.8.4.3.2.1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de ésta, en el recipiente de digestión.
B.8.4.3.2.2 Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado.
B.8.4.3.2.3 Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión.
B.8.4.3.2.4 Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15 lb por 30 min. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la temperatura a un máximo de 300 ºC por 30 min.
B.8.4.3.2.5 Enfriar a temperatura ambiente.
B.8.4.3.2.6 En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir la digestión.
B.8.4.3.2.7 Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg.
B.8.4.3.2.8 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.8.4.3.2.9 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).
B.8.4.4 Digestión para la determinación de As.
B.8.4.4.1 Digestión por vía húmeda-seca.
B.8.4.4.1.1 Proceder como en el punto (B.8.4.3.2) hasta que la digestión sea completa y posteriormente continuar con los siguientes pasos.
B.8.4.4.1.2 Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol Vycor o vaso de precipitados.
B.8.4.4.1.3 Añadir 1 ml de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a temperatura baja, hasta sequedad.
B.8.4.4.1.4 Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375 ºC.
B.8.4.4.1.5 Colocar el matraz en la mufla a 450 ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 min.
B.8.4.4.1.6 Enfriar y disolver el residuo en 2 ml de ácido clorhídrico 8 M.
B.8.4.4.1.7 Añadir 0,1 ml de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III).
B.8.4.4.1.8 Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 min y transferir a un matraz y llevar al aforo con agua.
B.8.4.4.1.9 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.8.4.4.1.10 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para horno de grafito o generador de hidruros).
B.8.4.4.2 Digestión por vía seca.
B.8.4.4.2.1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o de platino.
B.8.4.4.2.2 Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v.
B.8.4.4.2.3 Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol.
B.8.4.4.2.4 Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta 300 ºC por 2 h. Posteriormente subir gradualmente la temperatura hasta 500 ºC por 16 h o durante toda la noche.
B.8.4.4.2.5 Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v.
B.8.4.4.2.6 Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido.
B.8.4.4.2.7 Llevar los crisoles a una mufla elevando gradualmente la temperatura de 23 a 500 ºC, manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total.
B.8.4.4.2.8 Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 ml de ácido clorhídrico 0,5 N.
B.8.4.4.2.9 Enjuagar los crisoles con 5 ml de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 ml de solución de yoduro de potasio al 15% y mezclar.
B.8.4.4.2.10 Dejar reposar durante 15 min y llevar al aforo.
B.8.4.4.2.11 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.
B.8.4.4.2.12 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para horno de grafito o generador de hidruros).
B.8.4.5 Digestión para la determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, hierro, zinc y plata por horno de microondas.
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,5 g como máximo de muestra, añadir 6 ml de ácido nítrico concentrado y 2 ml de agua oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el envase de reacción y proceder según el manual del fabricante.
B.8.5 Procedimiento
B.8.5.1 Espectrometría de absorción atómica por flama.
B.8.5.1.1 Calibración. Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.
B.8.5.1.1.1 Se inicia la configuración operacional del instrumento y en el sistema de adquisición de datos. Permitir un periodo no menor a 30 min para el calentamiento de las lámparas de descarga sin electrodos.
B.8.5.1.1.2 Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 20 veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%.
B.8.5.1.1.3 El instrumento debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco de calibración y los estándares de calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración dentro del intervalo dinámico de concentración del analito.
B.8.5.1.1.4 Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de calibración del analito de menor a mayor concentración y registrar al menos tres réplicas de la absorbancia de cada uno.
B.8.5.1.1.5 Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración.
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.
B.8.5.1.2 Operación del instrumento.
El desempeño del instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibración, estándares de calibración y una muestra de control de calidad (MCC).
B.8.5.1.2.1 Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la posible causa de error, el instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibración.
B.8.5.1.2.2 Para verificar que el instrumento no presenta variación, por cada 10 análisis se debe analizar el blanco de calibración y un punto intermedio de la curva de calibración. Si el valor verdadero del analito difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse.
Si la matriz de la muestra es responsable de la variación o afecta la respuesta del analito puede ser necesario trabajar por adiciones estándar.
B.8.5.1.2.3 La demostración de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites de detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración lineal. Para determinar el LDM se usa un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectura de absorbancia del blanco de reactivos fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo con:
En donde:
t = valor de la "t" de Student a un intervalo de confianza de 95% y una desviación estándar estimada para n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas.
s = desviación estándar de las réplicas del análisis.
El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente concentración, uno de los cuales debe estar próximo al límite superior del intervalo lineal.
B.8.5.1.3 Determinación
B.8.5.1.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la determinación del analito de acuerdo con las indicaciones del manual del instrumento.
B.8.5.1.3.2 Introducir el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen de manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de contaminación del laboratorio.
B.8.5.1.3.3 En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del elemento en las unidades de concentración utilizadas.
B.8.5.1.3.4 Se debe analizar al menos un blanco de reactivos fortificado para cada grupo de muestras. Se calcula la exactitud como el porciento de recuperación (de acuerdo con el apartado B.8.5.1.3.6).
B.8.5.1.3.5 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia.
B.8.5.1.3.6 Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo con:
En donde:
CM = Concentración de la muestra fortificada
C = Concentración de la muestra
CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra.
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido y el blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones estándar.
B.8.5.2 Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito.
B.8.5.2.1 Calibración
B.8.5.2.1.1 Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.1.1 a B.8.5.1.1.4).
B.8.5.2.1.2 Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra concentración del analito.
La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los datos de concentración respuesta es aceptada.
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.
B.8.5.2.2 Operación del instrumento.
B.8.5.2.2.1 Proceder de acuerdo con (B.8.5.1.2.1 a B.8.5.1.2.3).
B.8.5.2.3 Determinación
B.8.5.2.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la determinación del analito, de acuerdo con las recomendaciones del manual del instrumento.
El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar dependiendo de la matriz de la muestra. En el caso de existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la luz), se recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas, así como en el caso de interferencias de matriz.
B.8.5.3 Espectrometría de absorción atómica por generador de hidruros.
B.8.5.3.1 Calibración
B.8.5.3.1.1 Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.1.1 a B.8.5.1.1.4).
B.8.5.3.1.2 A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en ácido clorhídrico de concentración apropiada al método. Trazar una curva de calibración de absorbancia (máximo de la altura de pico) en función de la concentración del analito para un intervalo de concentración de 0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra.
B.8.5.3.2 Operación del instrumento.
B.8.5.3.2.1 Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.2.1 a B.8.5.1.2.3).
B.8.5.3.3 Determinación
B.8.5.3.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la celda de absorción de acuerdo con el manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).
B.8.5.3.3.2 Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.
B.8.5.3.3.3 Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito (por lo general, 10 ml de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo de reacción y el tiempo de purga II.
B.8.5.3.3.4 Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares de calibración.
B.8.5.4 Espectrometría de absorción atómica por vapor frío.
B.8.5.4.1 Calibración
B.8.5.4.1.1 Proceder igual que en los puntos (B.8.5.1.1.1 a B.8.5.1.1.4.).
B.8.5.4.1.2 A partir de la solución de trabajo de 1 µg/ml preparar estándares de calibración que contengan 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de reacción. A cada frasco agregar 100 ml de la solución de dilución y 20 ml de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura máxima de pico) en función de la concentración del analito.
B.8.5.4.2 Operación del instrumento.
B.8.5.4.2.1 Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.2.1 a B.8.5.1.2.3).
B.8.5.4.3 Determinación
B.8.5.4.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar la celda de absorción de acuerdo con el manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).
B.8.5.4.3.2 Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.
B.8.5.4.3.3 Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito.
B.8.5.4.3.4 Tomar 25 ml de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares de calibración.
B.8.6 Expresión de resultados
B.8.6.1 Método de cálculo
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula:
En donde:
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración.
B = Volumen final al que se llevó la muestra (ml).
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (ml) en el caso de agua.
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del elemento en mg/kg o µg/kg.
B.8.7 Informe de la prueba
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar.
B.9 DETERMINACION DE MATERIA EXTRAÑA EN LECHE, FORMULA LACTEA O PRODUCTO LACTEO COMBINADO
B.9.1 Principio del método
Los insectos enteros, fragmentos de los mismos, pelos de roedor o alguna materia extraña se separan de la muestra por filtración para su identificación al microscopio.
B.9.2. Equipo
B.9.2.1 Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad
B.9.2.2 Equipo de filtración al vacío.
B.9.2.3 Microscopio binocular estereoscopio con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10 X, oculares apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X, respectivamente.
B.9.2.4 Lámpara para el microscopio o luz natural equivalente.
B.9.3 Materiales
B.9.3.1 Embudo Bchner.
B.9.3.2 Matraz Kitazato.
B.9.3.3 Vasos de precipitados de 1000 ml.
B.9.3.4 Caja Petri.
B.9.3.5 Papel de filtración rápida para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
B.9.3.6 Material común de laboratorio.
B.9.4. Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua debe entenderse agua destilada.
B.9.4.1 Solución de carbonato de sodio (Na2 CO3) al 2%.
Disolver 2 g de carbonato de sodio en agua y llevar al volumen de 100 ml.
B.9.4.2 Solución de oxalato de sodio (Na2 C2 O4) al 3%.
Disolver 3 g de oxalato de sodio Na2 C2O4 en agua y llevar al volumen de 100 ml.
B.9.4.3 Mezcla de glicerina:etanol 1:3 (v/v) (opcional).
B.9.5 Procedimiento
B.9.5.1 Preparación de la muestra
B.9.5.1.1 Productos líquidos
Mezclar bien todo el contenido de la muestra.
B.9.5.1.2 Productos deshidratados
Pesar por duplicado 50 g de leche descremada o 65 g de leche entera y reconstituir ajustando el volumen a 500 ml con agua a 40 ºC.
B.9.5.2 Determinación
B.9.5.2.1 Filtrar toda la muestra sobre un embudo de succión preparado con papel filtro para conteo, tratando de vertirlo uniformemente.
B.9.5.2.2 Durante la filtración lavar continuamente el papel filtro con agua a 80 ºC aproximadamente, para evitar la acumulación de partículas que tapen los poros del papel.
B.9.5.2.3 Pasar el papel filtro a una caja Petri y humedecerla con la mezcla glicerina-etanol (opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte que muestre los detalles en el papel filtro.
B.9.5.2.4 Contar con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea y explorar cada pieza del material dado que algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan.
B.9.6 Expresión de resultados
B.9.6.1 Productos deshidratados
| Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos de roedor y
cualquier materia extraña que se encuentre en 50 g o 65 g de muestra
|
B.9.6.2 Productos líquidos
| Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos de roedor y
cualquier materia extraña que se encuentre en la cantidad de ml que contenga el
envase analizado
|
METODOS PARA LA DETERMINACION DE NUTRIMENTOS
B.10 DETERMINACION DE VITAMINA A POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC EN FASE REVERSA)
B.10.1 Principio del método
Los lípidos son ésteres que en presencia de un álcali cáustico se hidrolizan liberando el material insaponificable, el cual es extraído con un disolvente orgánico. Posteriormente la vitamina A contenida en este material, es cuantificada por medio de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución.
B.10.2 Equipo
B.10.2.1. Sistema de HPLC que incluye:
B.10.2.1.1 Bomba HPLC.
B.10.2.1.2 Inyector automático o manual de muestras.
B.10.2.1.3 Detector espectrofotométrico de longitud de onda variable UV-Visible LC.
B.10.2.1.4 Integrador computarizado LC.
B.10.2.1.5 Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 µm, longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm.
B.10.2.2 Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg.
B.10.2.3 Placas de agitación con calentamiento.
B.10.2.4 Cilindro para gas comprimido de nitrógeno pureza 95%.
B.10.2.5 Cilindro para gas comprimido de helio pureza 95%.
B.10.2.6 Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño maría.
B.10.2.7 Equipo de filtración para la preparación de la fase móvil.
B.10.2.8 Cronómetro o reloj.
B.10.3 Materiales
B.10.3.1 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón con tapón de vidrio o teflón de 50 y 100 ml.
B.10.3.2 Matraces actínicos o de color marrón de fondo plano, cuello corto de 250 ml.
B.10.3.3 Matraces, en forma de pera actínicos o de color marrón, de cuello corto y boca esmerilada de 500 ml (que embone en el rotavapor).
B.10.3.4 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón de 10 ml.
B.10.3.5 Vasos de precipitados de 500 ml.
B.10.3.6 Embudo de separación cónico, actínicos o de color marrón, con llave de teflón 500 ml.
B.10.3.7 Embudo tallo corto diámetro 12 cm.
B.10.3.8 Tapones de teflón huecos hexagonales o actínicos o de color marrón.
B.10.3.9 Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 ml, de 50 cm de longitud aproximadamente.
B.10.3.10 Manguera de látex.
B.10.3.11 Papel filtro mediano No. 1 con diámetro de 18,5 cm.
B.10.3.12 Pipetas volumétricas con marca de 5 y 4 ml.
B.10.3.13 Jeringa de vidrio sin aguja desechable de 10 ml.
B.10.3.14 Jeringa de vidrio de 50 µl con aguja sin punta.
B.10.3.15 Filtros para jeringa (acrodiscos para HPLC) de 0,45 µm de tamaño de poro y diámetro de 25 mm, para solventes orgánicos y fase móvil.
B.10.3.16 Membranas de filtración de fluoruro de polivinilideno, utilizada para fases móviles (solventes orgánicos y acuosos), cuyos extractables sean de absorción en UV, u otro filtro para fines similares.
B.10.3.17 Magnetos para placa de agitación.
B.10.4 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico y por agua debe entenderse agua destilada.
B.10.4.1 Estándar de retinol (vitamina A) cristalizada (C20H30O) all trans RETINOL con certificado de pureza.
B.10.4.2 Hidróxido de potasio en lentejas (KOH).
B.10.4.3 Alcohol etílico absoluto (C2H5OH).
B.10.4.4 Eter de petróleo intervalo de ebullición 40 a 60 °C.
B.10.4.5 Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador (C20H14O4).
B.10.4.6 Metanol grado HPLC (CH3OH).
B.10.4.7 Agua destilada filtrada (sólo para la preparación de fase móvil).
B.10.4.8 Agua destilada que se utilizará en los lavados del saponificado (verificar que el valor de pH no sea mayor de 6,0).
B.10.4.9 Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).
B.10.4.10 Acido ascórbico (C6H8O6).
B.10.4.11 Fase móvil metanol: agua (95:5) para HPLC.
Pasar agua destilada a través de una membrana de filtración para soluciones acuosas. Pasar metanol a través de una membrana de filtración para solventes orgánicos. Posteriormente mezclar 50 ml de agua destilada en 950 ml de metanol (fase móvil). Degasificar la fase móvil pasando una ligera corriente de gas helio o por ultrasonido 15 min a temperatura ambiente.
B.10.4.12 Soluciones patrón de vitamina A
B.10.4.12.1 Solución concentrada (150 µg equivalentes de retinol). Justo antes de emplearse, pesar 15 mg de retinol cristalizado (A-OH) y registrar el peso exacto. Colocar el estándar pesado en un matraz volumétrico de 100 ml. Disolver con metanol y llevar al volumen.
B.10.4.12.2 Solución intermedia (15 µg equivalentes de retinol)
Diluir 5 ml de la solución concentrada a 50 ml con el mismo metanol para obtener una solución de aproximadamente 50 U.I./ml.
B.10.4.12.3 Solución de trabajo (6 µg equivalentes de retinol)
Añadir 4 ml de la solución estándar intermedia al matraz marcado como estándar y adicionar los reactivos al igual que al blanco y muestra como se indica en el apartado de saponificación. Esta solución tendrá aproximadamente 20 U.I./ml de vitamina A, al final del proceso de recuperación, en el matraz volumétrico de 10 ml.
Nota 1: Si el certificado de % de pureza en el estándar es inferior al 85% no debe prepararse la solución patrón, siendo necesario un nuevo estándar de otro lote con una pureza superior a la antes indicada.
Nota 2: La vitamina A-OH (A-alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz. Al abrir una ampolleta nueva de vitamina A-cristalizada, pesar la cantidad de estándar requerida y guardar la ampolleta bajo atmósfera de nitrógeno o en condiciones similares.
B.10.5 Procedimiento
Nota 3: La vitamina A es sensible a la luz. Utilizar material actínico o de color marrón o bien, proteger el material con papel aluminio. Por otra parte efectuar las evaporaciones con rotavapor a una temperatura máxima de 40 ºC. No evaporar a sequedad. Romper el vacío e inmediatamente introducir nitrógeno al sistema o al matraz. Evaporar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno sin llegar a la sequedad.
B.10.5.1 Toma de muestra
En el caso de productos deshidratados, reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas en la etiqueta o 130 g del producto llevados a 1 l con agua. Disolver y agitar la muestra a fin de homogeneizarla por completo.
Medir de preferencia por duplicado una cantidad de muestra tal, que contenga de 30 a 90 µg equivalentes de retinol (100 a 300 U.I. de vitamina A) o la cantidad correspondiente a lo declarado en la etiqueta de la muestra. En caso de no contar con esta información no es conveniente realizar el análisis.
B.10.5.2 Saponificación
B.10.5.2.1 Marcar 4 matraces actínicos de cuello corto y esmerilado con fondo plano de 250 ml (cuando la muestra se trabaje por duplicado) de la siguiente manera: blanco, estándar y muestra.
B.10.5.2.2 Añadir los siguientes reactivos a cada uno de los matraces antes mencionados: 7 g de hidróxido de potasio y a continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto. Mezclar para disolver. Agregar 0,5 g de ácido ascórbico así como una barra magnética. Adicionar una ligera corriente de nitrógeno a cada uno de los matraces.
B.10.5.2.3 Montar un sistema de reflujo y calentar durante 30 min en placas de calentamiento o baño de
agua en ebullición con agitación constante.
Nota 4: Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.
B.10.5.3 Extracción del insaponificable
B.10.5.3.1 Una vez concluido el tiempo de saponificación, enjuagar con máximo 30 ml de agua destilada (evitar el exceso de agua para prevenir la formación de emulsiones) por las paredes internas del refrigerante sin quitar el matraz del saponificado. Enfriar el matraz aún instalado al refrigerante sumergiéndolo parcialmente en un vaso de precipitados que contenga agua fría, lo anterior con la finalidad de llevarlo a temperatura ambiente, evitando enfriarlo demasiado. Trasvasar la suspensión a un embudo de separación de 500 ml.
B.10.5.3.2 Enseguida enjuagar el matraz con 100 ml de éter de petróleo que se añaden al embudo de separación. Extraer la vitamina A agitando ligeramente. Dejar separar las fases. Vaciar la fase acuosa a otro embudo de 500 ml. Recoger la fase orgánica a un tercer embudo de separación de 500 ml. Repetir la operación dos veces más, enjuagando el matraz con dos porciones de 100 ml de éter cada una.
B.10.5.3.3 Efectuar esta extracción 3 veces en total (un lavado de 50 ml y 2 lavados de 100 ml). Hacer las agitaciones con mucho cuidado para evitar emulsiones.
B.10.5.3.4 Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del embudo, agitando suavemente, hasta que el agua del lavado ya no dé reacción colorida con la fenolftaleína. Después del último lavado, esperar de 15 a 30 min antes de vaciar la fase acuosa y volver a revisar con el indicador que no exista reacción colorida.
B.10.5.3.5 Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 10 g de sulfato de sodio anhidro y recoger el filtrado en un matraz de pera de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Al final enjuagar el sulfato de sodio contenido en el filtro con 50 ml de éter de petróleo.
B.10.5.3.6 Evaporar el disolvente en un rotavapor a 40 ºC y dejar un remanente de aproximadamente 6 ml. Tratar de reducir esta cantidad del disolvente a un volumen de 2 ml aproximadamente mediante una corriente de nitrógeno.
B.10.5.3.7 Disolver el remanente obtenido con 3 ml de la fase móvil y recolectar cuantitativamente la solución con una jeringa de vidrio. Filtrar la solución a través de un filtro acrodisco de 0,45 µm a un matraz actínico de 10 ml. Lavar el matraz pera con porciones de 2 ml de fase móvil y repetir el mismo procedimiento hasta llegar al aforo del matraz. Hacer lo mismo para cada filtro de blanco, estándar y probar por duplicado.
Nota 5: Se recomienda acondicionar el acrodisco de 0,45 µm con metanol antes de utilizarlo en la filtración del recuperado.
B.10.5.4 Condiciones cromatográficas
B.10.5.4.1 Fijar los siguientes parámetros de acuerdo con las instrucciones de operación del cromatógrafo. Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 µm, longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm.
Loop de inyección: 20 µl.
Fase móvil: metanol: agua 95:5.
Flujo: 1 ml/min.
Detector: Longitud de onda ajustada a 325 nm.
Registrador: 5 mm/min.
B.10.5.5 Determinación de vitamina A
Inyectar dos veces los siguientes analitos: primero 20 µl del blanco, después 20 µl de la solución estándar para HPLC (20 U.I./ml aprox.) y por último 20 µl de la muestra (del saponificado).
B.10.5.5.1 En el cromatograma, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A correspondiente al estándar. Con estos datos, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A contenida en la muestra.
B.10.5.5.2 Calcular la altura del pico de la solución patrón y de las muestras en los cromatogramas obtenidos.
B.10.6 Cálculos
El contenido de vitamina A, expresado en Unidades Internacionales por litro de producto es igual a:
En donde:
m = toma de ensayo en g o ml.
hP = altura del pico de la muestra, en mm.
hS = altura del pico de la solución estándar final, en mm.
C = concentración de la solución estándar final inyectada, en U.I./ml para la vitamina A.
V = volumen de solución estándar final, en el cual ha sido diluido el remanente antes de la cromatografía.
Los resultados deben reportarse como µg equivalentes de retinol.
B.10.7 Expresión de resultados
µg equivalentes de retinol/l
1 U.I.= 0,3 µg equivalentes de retinol (todos los retinoles trans)
B.11 DETERMINACION DE LAS VITAMINAS A Y E POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION (HPLC EN FASE NORMAL)
B.11.1 Fundamento
Saponificación de la muestra; extracción de los compuestos insaponificables; evaporación y redisolución en n-hexano e inyección en la columna en fase normal
B.11.2 Material y equipo
Todo el material utilizado debe estar estéril
Instalación HPLC isocrática
Uno o dos registradores
Balanza analítica con capacidad de 160 g lectura 0,1 mg
Balanza de precisión con capacidad de 1600 g lectura 0,01 g
Estufa de laboratorio (para productos con almidón)
Baño maría con agitadores magnéticos de 4 plazas
Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño
Matraces aforados vidrio marrón con tapón de vidrio de 50 y 100 ml
Matraz de fondo plano con cuello corto de 250 ml
Matraces en forma de pera con vidrio marrón de 10 y 500 ml
Embudo de separación cónico vidrio marrón con llave de 500 ml
Embudo vidrio marrón, diámetro 12 cm
Tapones huecos hexagonales vidrio marrón
Refrigerante con macho y hembra manguito 300 mm
Alargadera para introducción de gas
Ampolleta de vidrio marrón de 5 ml
Filtro plisado mediano con diámetro de 18,5 cm
Pipetas aforadas con una marca de 3 y 5 ml
Jeringuillas de 1 y 5 ml
Aguja para jeringuillas
Cilindro para gas comprimido de nitrógeno
Monodetentor para gas comprimido, nitrógeno
Filtro de 0,45 µ de diámetro
Columna de 5 µ, 4,6 X 250
Aparato de filtración
Filtro 0,5 µ
B.11.3 Reactivos
Retinol (vitamina A) cristalizada (C20H30O)
DL-alfa-tocoferol (vitamina E) para fines bioquímicos (C29H50O2)
Hidróxido de potasio en lentejas para análisis (KOH)
Alcohol etílico absoluto, para análisis (C2H5OH)
Hidroquinona (C6H4(OH)2)
Eter de petróleo para análisis intervalo de ebullición 40 - 60 ºC
Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador ((C6H4OH)2COC6H4CO)
diastasa (para productos de almidón)
2-propanol ((CH3)2CHOH)
n-hexano (CH3(CH2)4CH3)
Sulfato de sodio anhidro para análisis (Na2SO4)
Nitrógeno (N2)
Acido ascórbico (C6H8O6)
B.11.3.1 Fase móvil para HPLC, 2-propanol al 1% en n-hexano.
Degasificar el n-hexano bajo presión reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 10 ml de 2 propanol con 990ml de n-hexano degasificado.
B.11.3.2 Solución patrón de vitamina A
B.11.3.2.1 Solución concentrada
Justo antes del uso, pesar en un matraz aforado de 100 ml aproximadamente 15 mg de retinol cristalizado (A - OH) y tomar el peso exacto, disolver en n-hexano y llevar a volumen con el mismo disolvente (= solución de aproximadamente 500 U.I./ml).
Esta solución permanece estable 1 semana a 4 ºC.
B.11.3.2.2 Solución para HPLC
Diluir 5 ml de solución (B.11.3.2.1) a 50 ml con el mismo disolvente para obtener una solución de aproximadamente 50 U.I./ml
Medir la extinción (E) a 325 nm y determinar la concentración de la vitamina A-OH, en U.I./ml, según:
1%
E1cm en n-hexano = 1815
Para 1 U.I. A-OH/ml E = 0,0545
Si el contenido es inferior a 85% del valor teórico no puede utilizarse esta solución patrón, es necesaria una nueva preparación. Si se obtiene otro valor debe considerarse en los cálculos finales.
NOTA:
La vitamina A-OH (A-alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz. Al abrir una nueva ampolleta de vitamina A-alcohol cristalizada, distribuir el contenido a razón de 50 mg en pequeñas ampolletas marrones. Trabajar en una cámara oscura. Las ampolletas deben cerrarse inmediatamente bajo nitrógeno.
B.11.3.3 Solución patrón de vitamina E
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 100 mg de alfa- tocoferol (E-OH), disolver en n-hexano y llevar al volumen con el mismo disolvente.
Diluir esta solución 5 veces con el mismo disolvente para obtener una solución de 0,2 mg/ml. Esta solución permanece estable una semana a 4 ºC.
B.11.4 Procedimiento
NOTAS:
Las vitaminas A y E son sensibles a la luz. Utilizar material de vidrio marrón, o proteger el material corriente con papel aluminio.
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 40 ºC. No debe evaporarse a seco. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema. Evaporar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno.
B.11.4.1 Toma de ensayo
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una toma de ensayo que contenga 100 a 300 UI de vitamina A y 0,5 a 1 mg de vitamina E, lo que corresponde en general a 10 g.
B.11.4.1.1 Productos con almidón
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 10% de su peso de diastasa. Añadir máximo 30 ml de agua destilada a 45 a 50 ºC. Mezclar bien para obtener una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 30 min en una estufa a 45 ºC.
B.11.4.1.2 Productos sin almidón
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con máximo 30 ml de agua destilada a 45 a 50 ºC.
B.11.4.2 Saponificación
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en el matraz B.34.3.3.1 o B.34.3.1.2, y mezclar para disolver. A continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.
Montar sobre un sistema de reflujo, introducir una ligera corriente de gas nitrógeno y calentar durante 30 min en un baño maría ebulliendo provisto de agitadores magnéticos.
NOTA:
Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.
B.11.4.3 Extracción del insaponificable
Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz a temperatura ambiente y trasvasar la suspensión a un embudo de separación de 500 ml.
Enjuagar con máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al contenido del embudo de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones.
Enseguida enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (rango de 40 a 60 ºC) en varias porciones que se añaden al embudo de separación. Extraer las vitaminas A y E agitando ligeramente. Dejar separar las fases. Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación de 500 ml. Recoger la fase orgánica en un tercer embudo de separación de 500 ml.
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar emulsiones.
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del embudo, sin agitar, hasta que el agua de lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último lavado, esperar al menos 15 min antes de vaciar la fase acuosa.
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de sodio anhidro o en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en forma de pera de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el filtro con 50 ml de éter de petróleo.
Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un rotavapor a 40 ºC, y eliminar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno.
Disolver el residuo en 3 ml de la fase móvil (B.11.2.1) y filtrar la solución inmediatamente a través de un filtro de 0,45 µ de tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos, recoger el filtrado en un matraz. El filtrado debe ser límpido.
La solución está lista para la cromatografía.
B.11.5 Cromatografía
Condiciones:
Columnna: Spherisorb Sílice, 5 µm, 4,6 X 250 mm
Loop de inyeccción: 20 µl
Fase móvil: 1% 2-propanol en n-hexano (34.3.1)
Caudal: 2 ml/min
Detector: ya sea: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 292 nm, 0,2 AUFS
ya sea: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 325 nm, 0,2 AUFS, para la vitamina A, en serie con espectrofluorímetro para vitamina E.
Ex: 294 nm, Em: 236 nm.
Registrador: 10 mm/min
Inyectar primero 20 µl de solución patrón de vitamina E (B.11.3.3) y determinar el tiempo de retención: debe ser aproximadamente 8 min. En seguida inyectar 20 µl de extracto obtenido bajo B.11.3.
B.11.6 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados
B.11.6.1 Evaluación
Identificar los picos de las vitaminas A y E en el cromatograma de la muestra mediante el tiempo de retención definido por cromatografía de la solución de la muestra y de la solución patrón correspondiente.
El contenido en vitamina A, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, y el contenido en vitamina E, expresado en mg por 100 g de producto, es igual a:
En donde:
m = toma de ensayo, en g.
hP = altura del pico de la muestra, en mm
hS = altura del pico de la solución patrón, en mm
C = concentración de la solución patrón inyectada, en U.I./ml para la vitamina A, y en mg/ml para la vitamina E
V = volumen, en ml, en el cual ha sido diluido el residuo antes de la cromatografía (3.3)
B.11.6.2 Límite de detección de acuerdo con la sensibilidad del equipo.
1 mg de D- á - tocoferil acetato es = 1 U.I. de vit. E
1 mg de DL- á - tocoferol = 1,1 U.I. de vit. E
Vitamina A: aproximadamente 50 U.I./ 100 g
Vitamina E: espectrofotometría: aprox. 0,5 mg/100 g
fluorimetría: aprox. 0,2 mg/100 g
B.11.6.3 Repetibilidad
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de la media entre ambos resultados.
Cuando las vitaminas han sido añadidas por mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por el grado de homogeneidad del producto.
NOTA: Para la determinación de vitamina A, en leche seguir la metodología anterior leyendo con el detector de UV a 325 nm.
La determinación de vitamina A y vitamina E puede hacerse de manera conjunta contando con un detector de UV programable o con detector de UV y un fluorómetro. Si no se cuenta con detector de UV programable o fluorómetro, inyectar dos veces la muestra para determinar las vitaminas por separado.
B.11.6.4 El contenido de tiamina en los productos objeto de esta Norma no debe ser inferior a 100 µg/100 g del producto listo para ser consumido.
Debe decir:
B.11.6.5 El contenido de tiamina en los productos objeto de esta Norma no debe ser inferior a 100 µg/100 kcal.
B.12 DETERMINACION DE VITAMINA D3 POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION (HPLC)
B.12.1 Preparación de la muestra
En el caso de productos deshidratados reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas en la etiqueta o 130 g de producto llevado a 1 l con agua. Disolver y agitar la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Medir de preferencia por duplicado una cantidad de muestra que contenga de 0,5 a 1 µg de vitamina D3 (20 a 40 U.I.).
B.12.2 Fundamento
Saponificación alcalina de la muestra; extracción con éter de compuestos insaponificables; evaporación del éter; solución del residuo seco en hexano e inyección de una alícuota en columna preparativa de HPLC (fase normal, Sílice). Colección del eluato que contiene la fracción de vitamina D; evaporación de esta fracción a sequedad, disolución en la fase móvil de HPLC (Analítica, Acetonitrilo: Cloruro de metileno: Isopropanol), inyección en HPLC (fase reversa C18) y determinación de la vitamina D con el pico máximo a 264 nm por calibración del estándar externo.
B.12.3 Material
Instalación de bomba HPLC
Uno o dos registradores
Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg
Balanza de precisión, con capacidad de 1600 g, lectura 0,01 g
Estufa de laboratorio (para productos con almidón)
Baño de agua con agitadores magnéticos, 4 plazas
Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño
Matraces aforados, vidrio marrón, tapón de vidrio de 5, 50 y 100 ml
Matraz de fondo plano, cuello corto, vidrio marrón de 250 ml
Matraces, en forma de pera, vidrio marrón de 10 y 500 ml
Embudo de separación cónico, vidrio marrón, con llave de 500 ml
Embudo, vidrio marrón, diámetro 12 cm
Tapones huecos hexagonales, vidrio marrón
Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mm
Alargadera para introducción de gas
Filtro plisado mediano con diámetro de 18,5 cm
Pipeta aforada, con una marca de 2 ml
Jeringuillas de 1 y 5 ml
Aguja para jeringuillas
Cilindro para gas comprimido, nitrógeno
Monodetentor para gas comprimido, N2
Filtro de 0,45 µ de diámetro
2 Columnas de 5 µ, 4,6 X 250
Aparato de filtración
Filtro 0,5 µ
B.12.4 Reactivos
Colecalciferol, vitamina D3, cristalizada para fines bioquímicos (C27H44O)
Hidróxido de potasio en lentejas para análisis (KOH)
Alcohol etílico absoluto, para análisis (C2H5OH)
Hidroquinona (C6H4(OH)2)
Eter de petróleo para análisis intervalo de ebullición 40 -60 °C
Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador ((C6H4OH)2C6H4COOC)
Diastasa (para productos de almidón)
2-propanol (CH3)2CHOH
n-hexano CH3(CH2)4CH3
Acetonitrilo (CH3CN)
Diclorometano (CH2C12)
Sulfato de sodio anhidro para análisis (Na2SO4)
Nitrógeno (N2)
Acido ascórbico (C6H8O6)
B.12.4.1 Fase móvil para HPLC preparativa, 2-propanol al 1% en n-hexano
Degasificar el n-hexano bajo presión reducida y pasar sobre un filtro. Mezclar 100 ml de diclorometano con 900 ml de acetonitrilo degasificado.
B.12.4.2 Fase móvil para HPLC analítica
Degasificar 1 l de acetonitrilo bajo presión reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 100 ml de diclorometano con 890 ml de acetonitrilo degasificado y 10 ml de 2-propanol.
Nota: La proporción diclorometano/acetonitrilo debe adaptarse de modo que la vitamina D3 dé un tiempo de retención de aproximadamente 8-9 min. Sin embargo, no debería rebasar 20:100.
B.12.4.3 Fase móvil para lavar la columna preparativa, 2-propanol al 10% en n-hexano
Mezclar 100 ml de 2-propanol con 900 ml de n-hexano degasificado.
B.12.4.4 Solución patrón de vitamina D3 para HPLC preparativa
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 50 mg de colecalciferol (D3) cristalizado, disolver en n-hexano y llevar al volumen con el mismo disolvente (= solución de 20,000 U.I./ml).
Diluir esta solución 1000 veces con el mismo disolvente para obtener una solución de 20 U.I./ml. Esta solución permanece estable de 3 a 4 semanas a + 4 °C.
B.12.4.5 Solución patrón de vitamina D3 para HPLC analítica
Evaporar 2 ml de solución patrón de 20 U.I./ml (B.12.4.4) y tomar el residuo en 2 ml de fase móvil (B.12.4.2).
B.12.5 Procedimiento
Notas: La vitamina D3 es sensible a la luz. Utilizar material de vidrio marrón o proteger el material corriente con papel aluminio.
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 40 °C. No se debe evaporar a sequedad. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema. Evaporar los últimos ml mediante una corriente de nitrógeno.
Al final de la jornada, lavar la columna preparativa durante 15 min con 2-propanol al 10% en n-hexano (B.12.4.3) con un caudal de 2 ml/min.
B.12.5.1 Toma de ensayo
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una toma de ensayo que contenga 20 a 40 U.I. de vitamina D3, lo que corresponde en general a 10 g.
B.12.5.1.1 Productos con almidón
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 10% de su peso de diastasa. Añadir máximo 30 ml de agua destilada a 45-50 °C. Mezclar bien para obtener una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante
30 min en una estufa a 45 °C.
B.12.5.1.2 Productos sin almidón
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con máximo 30 ml de agua destilada a 45-50 °C.
B.12.5.2 Saponificación
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en el matraz (B.12.5.1.1 o B.12.5.1.2), y mezclar para disolver.
A continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.
Montar sobre el matraz una alargadera para introducción de un gas refrigerante. Introducir una ligera corriente de gas nitrógeno, y calentar durante 30 min a 70 °C en un baño de agua en ebullición provisto de agitadores magnéticos.
Nota: Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.
B.12.5.3 Extracción del insaponificable
Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz a temperatura ambiente y transferir la suspensión a un embudo de separación de 500 ml.
Enjuagar con máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al contenido del embudo de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones.
En seguida enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (rango de 40 a 60 °C) en varias porciones que se añaden al embudo de separación.
Extraer la vitamina D3 agitando ligeramente.
Dejar separar las fases.
Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación de 500 ml. Recoger la fase orgánica en un tercer embudo de separación de 500 ml.
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar emulsiones.
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del embudo, sin agitar, hasta que el agua de lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último lavado, esperar al menos 15 min antes de vaciar la fase acuosa.
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de sodio anhidro o en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en forma de pera de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el filtro con 50 ml de éter de petróleo.
Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un rotavapor a 40 °C, y eliminar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno.
Transferir el residuo cuantitativamente a un matraz aforado de 5 ml, mediante pequeñas porciones de fase móvil (B.12.4.1) llevar al volumen y filtrar la solución inmediatamente a través de un filtro de 0,45 m de tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos, por ejemplo Acrodisc-CR o equivalente; recoger el filtrado en un matraz en forma de pera. El filtrado debe ser límpido.
La solución está lista para la cromatografía.
B.12.5.4 Cromatografía preparativa
Condiciones:
Columna: Spherisorb Si, 5 mcm, 4,6 x 250 mm
Loop de inyección: 500 ml
Fase móvil: 1% 2-propanol en n-hexano (B.12.4.1)
Caudal: 1-3 ml/min (el tiempo de retención de la vitamina D3 debe ser de aproximadamente 5 min).
Detector: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm (o eventualmente espectrofotómetro de longitud de onda fija a 254 nm, únicamente utilizable para la etapa preparativa), 0,05 AUFS para el patrón y 0,5 AUFS para el extracto de muestra
Registrador: 10 mm/min.
Inyectar primero 500 ml de solución patrón de vitamina D3 (B.12.4.4) y determinar el tiempo de retención:
Debe ser aproximadamente 5 min. Inyectar a continuación la solución de la muestra obtenida bajo el numeral (B.12.5.3) y recoger la fracción que contiene la vitamina D3 en un matraz en forma de pera de 10 ml.
Comenzando a recoger aproximadamente 1 min antes de la elución de la vitamina D3 y parar aproximadamente 1 min después de la elución de la vitamina D3.
B.12.5.5 Cromatografía analítica
Evaporar a seco la fracción recogida bajo (B.12.5.4), mediante una ligera corriente de nitrógeno.
Enfriar el matraz a fin de evitar errores de volumen a una evaporación eventual de disolvente; luego tomar el residuo en 300 ml de fase móvil (B.12.4.2), agitar ligeramente para disolver bien el residuo. Condiciones:
Columna: Spherisorb ODS, 5 mcm, 4,6 x 250 mm
Loop de inyección: 100 ml
Fase móvil: 10% diclorometano, 89% acetonitrilo y 1% de 2-propanol
Caudal: 2 ml/min
Detector: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm; 0,01 AUFS
Registrador: 10 mm/min
Inyectar primero 100 µl de solución patrón (B.12.4.5) y determinar el tiempo de retención: debe ser aproximadamente 8-9 min (adaptar la proporción de diclorometano/acetonitrilo si es necesario). Luego inyectar 100 ml de la fracción obtenida bajo B.12.5.4.
B.12.6 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados
B.12.6.1 Evaluación
Identificar el pico de la vitamina D3 en el cromatograma de la muestra mediante el tiempo de retención definido por cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los picos obtenidos durante la cromatografía de la solución patrón y de la solución muestra.
El contenido en vitamina D3, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, es igual a:
En donde:
m = toma de ensayo, en g
hP = altura del pico de la muestra, en mm
hS = altura del pico de la solución patrón, en mm
C = concentración de la solución patrón inyectada, en U.I./ml
V0 = volumen en el cual ha sido diluido el residuo antes de la cromatografía preparativa (B.12.5.3) (en general 5 ml = matraz aforado)
V1 = volumen del extracto inyectado en la columna preparativa (en general 0,500 ml=volumen del loop de inyección)
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en general 0,300 ml)
Nota: es superfluo un factor de corrección para la isomerización de la vitamina D3, en previtamina D3, ya que este fenómeno es despreciable en las condiciones de saponificación aplicadas.
B.12.6.2 Límite de detección de acuerdo con la sensibilidad del equipo.
Aproximadamente: 20 U.I./100 g
B.12.6.3 Repetibilidad
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de la media entre ambos resultados.
Cuando las vitaminas han sido añadidas por mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por el grado de homogeneidad del producto
B.13 DETERMINACION DE VITAMINA C (ACIDO ASCORBICO)
B.13.1 Determinación visual
B.13.1.1 Fundamento
Extracción del ácido ascórbico mediante ácido metafosfórico. Valoración visual oxidométrica del ácido ascórbico en el extracto con una solución de 2,6-diclorofenol-indofenol.
B.13.1.2 Reactivos y materiales
B.13.1.2.1 Reactivos
Acido ascórbico
Acido sulfúrico
Acido metafosfórico
Yodo
Sal sódica de 2,6-diclorofenol-indofenol
B.13.1.2.2 Materiales
Pipetas
Matraces aforados
Material común de laboratorio
B.13.1.3 Aparatos e instrumentos
Parrilla de calentamiento
Estufa
B.13.1.4 Preparación de soluciones
B.13.1.4.1 Solución estándar de ácido ascórbico 0,5 mg/ml
Pesar exactamente 50,0 mg de ácido ascórbico, introducirlos en un matraz aforado de 100 ml, si es posible, de vidrio pardo. Disolver con ácido metafosfórico al 2% y llevar a volumen con el mismo ácido. Esta solución debe prepararse inmediatamente antes del empleo.
B.13.1.4.1.1 Verificación de la pureza del ácido ascórbico
En caso de duda sobre la pureza del ácido ascórbico, pesar aproximadamente 400 mg con una precisión de 1 mg, disolver en una mezcla de 100 ml de agua destilada hervida y enfriada, y 25 ml de ácido sulfúrico al 10%. Valorar rápidamente bajo luz difusa con una solución de yodo, 0,1 N en presencia de una solución de almidón como indicador.
1 ml de yodo 0,1 N corresponde a 8,806 mg de ácido ascórbico.
B.13.1.4.2 Solución de ácido meta-fosfórico al 2%
B.13.1.4.2.1 Preparación de la solución base al 10%
Pesar 60-70 g de ácido meta-fosfórico. Eliminar la capa blanca que se forma generalmente en la superficie, lavando las barritas con agua destilada. Secarlas, con papel filtro y triturarlas en un mortero. Pesar 50 g de este ácido limpio y triturado, y disolverlo sin calentar en 500 ml de agua destilada en un frasco pardo, agitando este último mecánicamente hasta disolución.
Filtrar, si es necesario, sobre un filtro plegado en un frasco de vidrio pardo.
El ácido meta-fosfórico se transforma gradualmente en ácido orto-fosfórico, pero esta solución al 10% puede conservarse en un refrigerador durante tres semanas.
B.13.1.4.2.2 Preparación de la solución al 2%
Preparar la cantidad necesaria en el día de empleo, diluyendo cinco veces con agua destilada un volumen dado de la solución al 10%.
B.13.1.4.3 Solución de la sal sódica de 2,6-diclorofenol-indofenol (D.I.) al 0,05%
Disolver 100 mg de D.I. en un vaso de 50 ml que contenga 20 ml de agua destilada. Llevar rápidamente a ebullición, removiendo con una varilla de vidrio. Enfriar y transferir a un matraz aforado de 200 ml. Llevar a volumen con agua destilada. Filtrar en un frasco pardo. Esta solución se conserva en un refrigerador durante 8 días.
Verificar la concentración antes de cada serie de determinaciones.
La solución es azul en un medio alcalino (sal de Na+) y rosa en un medio ácido.
B.13.1.4.4 Acido acético al 10%
Diluir 100 ml de ácido acético glacial a 1 l con agua destilada.
B.13.1.4.5 Eventualmente: solución de yodo 0,1 N con factor conocido (determinado con tiosulfato).
B.13.1.4.6 Eventualmente: solución de ácido sulfúrico al 10%
Añadir cuidadosamente 57 ml de ácido sulfúrico concentrado a 500 ml de agua destilada. Enfriar a la temperatura ambiente y diluir a 1 l con agua destilada.
B.13.1.4.7 Eventualmente: solución de almidón estabilizada al 1%
Disolver 140 g de cloruro de sodio grado purísimo en 375 ml de agua destilada, añadir 5 g de almidón soluble disuelto en 5 ml de agua destilada, calentar a ebullición durante 2 o 3 min, enfriar y filtrar.
B.13.1.5 Procedimiento
B.13.1.5.1 Determinación del título de la solución de 2,6-diclorofenol-indofenol (D.I.)
Pipetear 3 ml de solución estándar de ácido ascórbico (B.13.1.4.2) en un vaso de 100 ml, añadir aproximadamente 30 ml de ácido meta-fosfórico al 2% y 5 ml de ácido acético al 10%. Valorar con la solución D.I. utilizando un agitador mecánico hasta la aparición de una coloración rosa que persista durante 15 seg.
Ejemplo:
Para 2 ml de solución estándar (= 1,5 mg de ácido ascórbico), volumen empleado 5,84 ml de reactivo:
es decir, 1 ml de solución D.I. corresponde a 0,257 mg de ácido ascórbico.
B.13.1.5.2 Preparación de la porción para ensayo
B.13.1.5.2.1 Producto sin o con poco almidón. Por ejemplo leche en polvo.
Pesar con una precisión de 0,1 g una cantidad del producto a analizar que contenga aproximadamente 5 a 10 mg de ácido ascórbico; en la mayoría de los casos se pesan 10 g en un matraz aforado de 100 ml.
Añadir 20 ml de ácido meta-fosfórico al 10% y 50 ml de agua destilada a 55 °C. Sacudir vigorosamente durante 10 min. Enfriar y llevar a volumen con agua destilada.
Filtrar rápidamente sobre un filtro plegado, al abrigo de la luz. Las soluciones que filtran demasiado lento deben centrifugarse a 3000 rpm durante 10 min, decantarse y filtrarse por un filtro plegado o sobre lana de vidrio.
B.13.1.5.2.2 Productos con almidón, por ejemplo cereales
En un vaso de 100 ml pesar exactamente una porción para ensayo de 10 a 20 g. Añadir 5% (0,5 a 1 g) de diastasa y 20 ml de agua destilada. Mezclar mediante una varilla de vidrio de modo que se obtenga una papilla homogénea e incubar 15 min en una estufa a 40 °C. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml con 20 ml de solución de ácido meta-fosfórico al 10%; llevar a volumen con agua destilada y agitar
vigorosamente. Filtrar sobre un filtro plegado con una velocidad de filtración media.
B.13.1.5.2.3 Productos heterogéneos, por ejemplo verdura, fruta
Homogeneizar una muestra de 50 a 100 g con un volumen de ácido meta-fosfórico de 10% representando 1/5 del volumen total al que será ajustada la mezcla.
Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml y llevar a volumen con agua destilada.
Centrifugar o filtrar la solución obtenida sobre un filtro plegado.
B.13.1.6 Determinación
Tomar una parte alícuota del filtrado correspondiente, de 1-2 mg de ácido ascórbico. Añadir 5 ml de ácido acético al 10% (10 ml para un volumen de filtrado de 30 a 50 ml), valorar luego con D.I. hasta que se obtenga una coloración rosa que persista durante 15 seg.
Generalmente, deben utilizarse 5 a 10 ml de reactivo para la valoración. Un volumen de reactivo que excede 10 ml no es aconsejable, ya que la solución tiene tendencia a volverse grisácea en estas condiciones.
Nota:
Preparar las muestras a medida que se valoran.
B.13.1.7 Cálculo y expresión de los resultados
B.13.1.7.1 Cálculo y fórmula
El contenido de ácido ascórbico expresado en mg por 100 g de producto es igual a:
En donde:
a = ml de reactivo empleados
T = título del reactivo
v = ml de filtrado empleados
V = ml de solución de la toma de ensayo
m = toma de ensayo
Expresar el valor obtenido con una precisión de 0,1 mg.
B.13.2 Valoración con un potenciómetro (medidor de pH)
B.13.2.1 Preparación de la toma de ensayo
La solución se prepara según las indicaciones dadas para la valoración visual.
Tomar una parte alícuota de la solución a valorar que contenga 1 a 2 mg de ácido ascórbico. Añadir 5 ml de ácido acético al 10%.
B.13.2.2 Determinación
Colocar el recipiente de valoración, que contiene la solución a valorar y una barrita magnética, sobre un agitador magnético.
Sumergir un electrodo de platino combinado en la solución.
Ajustar el potenciómetro a una alta sensibilidad y llevar la aguja hacia el punto 0, o a un valor que corresponda a aproximadamente 1/6 de la escala, si el punto 0 se encuentra al comienzo de la misma.
Añadir, mediante una bureta motorizada, porciones de reactivo de 0,1 ml a intervalos de 5 seg. La aguja del potenciómetro sube ligeramente con cada adición de reactivo, pero baja de nuevo inmediatamente.
El punto alcanzado por la aguja, 5 seg después de cada adición de reactivo comienza por ser cada vez más bajo para subir de nuevo progresivamente.
Cuando la amplitud de oscilación de la aguja aumente y el punto alcanzado 5 seg después de la adición
del reactivo es netamente más alto, añadir el reactivo en porciones de 0,05 ml y esperar antes de cada nueva adición hasta que la aguja baje de nuevo ligeramente.
Proseguir de esta manera hasta que la aguja baje de nuevo muy poco, añadir luego muy pequeñas porciones de reactivo hasta que la aguja no baje más, sino que permanezca en el punto alcanzado después de la última adición de reactivo.
Este punto será considerado como el punto de equivalencia. Anotar el número de ml de reactivo utilizados para alcanzar dicho punto.
B.13.2.3 Cálculo y expresión de los resultados
B.13.2.3.1 Cálculo
El contenido en ácido ascórbico expresado en mg/100 g de producto es igual a:
En donde:
a = ml de reactivo correspondiente al punto de equivalencia
T = concentración del reactivo
v = ml de filtrado empleados
V = volumen en ml de la solución de la toma de ensayo
m = toma de ensayo en g
B.13.2.3.2 Expresar el valor obtenido con una precisión de 0,1 mg.
B.13.2.4 Repetibilidad
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones, simultáneamente o rápidamente una después de otra por el mismo analista, no debe exceder 0,8 mg para un producto que contenga aproximadamente 50 mg de ácido ascórbico por 100 g.
B.14 DETERMINACION DE TIAMINA (VITAMINA B1) Y RIBOFLAVINA (VITAMINA B2) POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
B.14.1 Fundamento
La vitamina B1, es extraída de la muestra por hidrólisis ácida y oxidada a tiocromo, su contenido es determinado por HPLC en fase inversa con detección fluorométrica.
B.14.2 Reactivos y materiales
B.14.2.1 Reactivos
Acido clorhídrico fumante, 37% para análisis (HCl)
Acetato de sodio trihidratado, para análisis
(CH3 x CO2Na x 3H2O)
Acido orto-fosfórico PO4H3 (P2O5 x 3H2O)
Ferricianuro de potasio, para análisis Fe(CN) 6K4 x 3H2O
Hidróxido de sodio en lentejas, para análisis.
Monohidrato de tiamina (nitrato de tiamina, Vitamina B1 monohidratada), calidad alimentaria (C12H17N5O4S)
Papaína soluble.
Amilasa
Diastasa
N,N - Dimetilformamida HCON(CH3) 3
fosfato, ácido de-potasio, para análisis (K2HPO4 x 3H2O)
B.14.2.2 Materiales
Matraces en forma de pera, 100 ml
Tapones huecos hexagonales
Matraces aforados, de vidrio de 1000, 100, 50 y 10 ml
Embudos de vidrio de 100 mm de diámetro
Matraces Erlenmeyer, de cuello estrecho, 250 ml
Refrigerante, Allihn, manguito 300 mm
Filtros plisados medianos 185 mm de diámetro
Pipetas aforadas con una marca de 2, 3, 5 y 40 ml
Pipetas graduadas hasta la punta de 1 ml: 0,005
Probetas graduadas, en forma alta, de 50 ml: 0,5; 100 ml: 1,0
1000 ml: 10
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.
B.14.2.3 Aparatos e instrumentos
Balanza analítica, 162 g, lectura 0,1 mg
Balanza de precisión electrónica, 2100 g, lectura 0,01 g
Baño de agua en línea con soportes, 6 plazas.
Estufa de laboratorio
Jeringuilla para HPLC, de un 1 ml
Aguja para jeringuilla
Columna ODS o C 18, 5 µm, 250 x 4,6 mm; o equivalente
Dispositivo de filtración sobre membrana
Membrana para filtro
B.14.4 Preparación de soluciones
B.14.4.1 Solución de ácido clorhídrico
En un matraz aforado de 1000 ml que contenga aproximadamente 500 ml de agua destilada, añadir con cuidado 82 ml de ácido clorhídrico al 37% y llevar a volumen con agua destilada. Trabajar en campana de extracción.
B.14.4.2 Solución de acetato de sodio 2,5 M.
En un matraz aforado de 1000 ml disolver 340 g de acetato de sodio trihidratado en agua destilada y llevar a volumen.
B.14.4.3 Hidróxido de sodio, solución de 150 g/l
En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 160 g de hidróxido de sodio en lentejas en agua destilada,
llevar a volumen.
Conservar en un matraz provisto de un tapón de polietileno.
B.14.4.4 Solución de oxidación
B.14.4.4.1 Solución de ferricianuro de potasio 1g/100 ml
En un matraz aforado de 100 ml disolver, 1 g de ferricianuro de potasio en agua destilada y llevar a volumen.
B.14.4.4.2 Solución a preparar justo antes del uso
En un matraz aforado de 50 ml, llevar a volumen 2 ml de solución (B.14.4.4.1) con solución (B.14.4.3).
B.14.5 Fase móvil para HPLC
B.14.5.1 Solución de fosfato ácido de-potasio, 10 mM pH 7,2.
En un vaso de 1000 ml pesar exactamente 2,28 g de fosfato de-potasio, disolver en aproximadamente 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con ácido clorhídrico 1 N (B.14.4.1). Transferir a un matraz aforado de 1000 ml y llevar a volumen con agua destilada. Degasificar bajo presión reducida y filtrar.
B.14.5.2 Solución de dimetilformamida al 15% en fosfato ácido de potasio.
En un matraz aforado de 1000 ml agregar 150 ml de dimetilformamida y llevar a volumen con solución (B.14.5.1).
B.14.6 Solución patrón de vitamina B1
B.14.6.1 Solución concentrada
En un matraz aforado de 50 ml de vidrio, pesar exactamente 50,0 mg de monohidrato de tiamina y disolver en agua destilada. Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 1 N (B.14.4.1) y llevar a volumen con agua destilada. Esta solución contiene 1 mg/ml.
B.14.6.2 Soluciones diluidas
En un matraz aforado de 50 ml, agregar mediante una pipeta, 5 ml de solución (B.14.6.1) y llevar a volumen con agua destilada. Luego verter mediante una pipeta, 5 ml de esta solución (100 µg/ml) en un matraz aforado de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Esta solución contiene 10 µg/ml.
Verter, mediante una pipeta, 5 ml de esta solución en un matraz aforado de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Esta solución contiene 1 µg/ml.
B.14.6.3 Preparar de la misma manera solución concentrada de riboflavina y de manera subsecuente las soluciones diluidas. No es necesario utilizar matraces de vidrio.
B.14.6.4 Solución patrón oxidada para HPLC
Mediante una pipeta, verter 5 ml de solución (B.14.6.2) en un matraz aforado de 10 ml de vidrio. Añadir 3 ml de solución de ferricianuro de potasio básico (B.14.4.4.2). Agitar durante 2 min, añadir 0,45 ml de ácido fosfórico concentrado, mezclar, enfriar y llevar a volumen con agua destilada. Cromatografiar esta solución inmediatamente.
B.14.7 Procedimiento
La vitamina B1 no es sensible a la luz; en cambio el producto oxidado, el tiocromo, sí lo es. Durante la etapa de oxidación, utilizar material de vidrio actínico, o material de vidrio corriente protegido con papel aluminio.
B.14.7.1 Toma de ensayo
Homogeneizar toda la muestra, mezclando o moliendo y pesar con una aproximación de 10 mg, una toma de ensayo de 5 g.
Para la determinación de vitamina B2 adicionar 0,5 g de amilasa y 0,25 g de papaína, independientemente de si el producto contiene almidón o no.
B.14.7.1.1 Productos con almidón
En un matraz en forma de pera de 100 ml de vidrio con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 0,5 g de diastasa y 0,25 g de papaína. Añadir máximo 15 ml de agua destilada de 45 a 50 °C. Mezclar bien, a fin de obtener una suspensión homogénea. Tapar el matraz y colocarlo durante 30 min en una estufa a 40 °C. Añadir a continuación 30 ml de agua destilada de 45 a 50 °C.
B.14.7.1.2 Productos sin almidón, inclusive polvos para bebidas que contengan cacao
En un matraz en forma de pera de 100 ml de vidrio con cuello esmerilado mezclar la toma de ensayo con 45 ml de agua destilada de 45 a 50 °C. Mezclar bien, a fin de obtener una suspensión homogénea.
B.14.7.2 Hidrólisis
B.14.7.2.1 Productos con o sin almidón, excepto polvos para bebidas que contengan cacao
Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 1 N al matraz (B.14.7.1.1 o B.14.7.1.2). Mezclar bien, calentar durante 30 min bajo el reflujo en un baño de agua en ebullición. Al cabo de 15 min, agitar el matraz para deshacer los aglomerados.
Enfriar y añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5 M (B.14.4.2). Mezclar bien. Transferir cuantitativamente el contenido del matraz a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada.
Filtrar a través de un filtro plisado. La solución está lista para la oxidación.
B.14.7.2.2 Polvos para bebidas que contengan cacao
Proceder según (B.14.7.2.1) hasta el enfriamiento después de la hidrólisis. Transferir cuantitativamente el contenido del matraz a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada.
Filtrar a través de un filtro plisado. Luego verter, mediante una pipeta, 40 ml de filtrado en un matraz aforado de 50 ml (procedimiento especial para bebidas que contienen cacao por tener polifenoles que interfieren en la reacción de B1). Añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5 M (B.14.4.2) y llevar a volumen con agua destilada.
La solución está lista para la oxidación
B.14.7.3 Oxidación
En un matraz aforado de 10 ml de vidrio verter, mediante una pipeta, 5 ml de solución (B.14.7.2.1 o B.14.7.2.2). Añadir 3 ml de solución de ferricianuro de potasio básico (B.14.4.4.2). Agitar durante 2 min. Añadir 0,45 ml de ácido fosfórico concentrado, mezclar, enfriar y llevar a volumen con agua destilada. Cromatografiar esta solución inmediatamente.
B.14.7.4 HPLC
Condiciones
| Columna: | ODS o C 18, 5 µm; 250 X 4,6 mm o equivalente |
| Loop de inyección: | 50 µl |
| Fase móvil: | ver punto 15.5.2 |
| Caudal: | 1,5 ml/min |
| *Detector: | espectrofluorímetro, excitación: 368 nm emisión: 440 nm |
| Registrador: | 10 mm/min |
*Para la determinación de vitamina B2 se inyecta directamente del filtrado y se modifica la siguiente condición:
| Detector: | espectrofluorímetro; excitación: 450 nm |
| | emisión: 530 nm |
Inyectar primero 50 µl de solución patrón oxidada B.14.6.4 y determinar el tiempo de retención: debe ser de aproximadamente 5-6 min. A continuación inyectar 50 µl de la solución obtenida B.14.7.3.
B.14.8 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados
B.14.8.1 Evaluación
Identificar el pico del tiocromo o de la riboflavina en el cromatograma de la toma de ensayo mediante el tiempo de retención definido por cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los picos obtenidos al cromatografía la toma de ensayo y la solución patrón.
El contenido de vitamina B1, expresado en mg por 100 g de producto, es igual a:
En donde:
m = masa de la toma de ensayo, en g
hP = altura del pico del extracto, en mm
hS = altura del pico de la solución patrón, en mm
C = concentración de la solución patrón, en µg/ml
V = volumen, en mililitros, en el cual se ha diluido el extracto antes del análisis por HPLC (250 para polvos para bebidas que contengan aromas, 200 para los demás productos)
B.14.8.2 Repetibilidad
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de la media entre ambos resultados.
B.15 DETERMINACION DE NIACINA (VITAMINA B3) POR METODO MICROBIOLOGICO
B.15.1 Fundamento
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de niacina utilizando Lactobacillus plantarum ATCC 8014, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración de niacina. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio libre de niacina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación en la curva se determina la concentración de la muestra.
B.15.2 Reactivos y materiales
B.15.2.1 Reactivos
Acido nicotínico para fines bioquímicos
Acido clorhídrico fumante 37% para análisis
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis
Cristales de cloruro de sodio para análisis
B.15.2.2 Materiales
Micropipeta
Vasos de precipitados
Pipetas volumétricas
Matraces Erlenmeyer
Matraces volumétricos
Tubos de ensaye
B.15.3 Aparatos e instrumentos
Autoclave
Incubadora a 35 ± 1 °C
Espectrofotómetro
Centrífuga
B.15.4 Cepa y medios de cultivo
Lactobacillus plantarum ATCC 8014
Leche descremada en polvo grado reactivo
Caldo micro inoculum
Agar bacteriológico
Caldo Bacto Lactobacilli
Medio de prueba para niacina
B.15.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar)
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico según las indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición vertical.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.15.4.2 Mantenimiento de la cepa
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el medio (B.15.4.1) cada cuatro semanas, efectuar un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido (B.15.4.3). Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 18 h a 35 °C.
B.15.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo
Caldo Micro Inoculum
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.15.5 Preparación de soluciones
B.15.5.1 Solución fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121 °C.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.15.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 1 N
Bajo una campana de extracción diluir 82 ml de ácido clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de 1000 ml con agua destilada. Para ello verter el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.
B.15.5.3 Solución de hidróxido de sodio 15 N.
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500 ml en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de goma.
B.15.5.4 Solución de Hidróxido de sodio aproximadamente 1 N
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml con tapón de polietileno.
B.15.5.5 Solución patrón
Justo antes del uso, pesar exactamente 50,0 mg de ácido nicotínico; disolver en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml.
B.15.6 Procedimiento
B.15.6.1 Desarrollo del microorganismo
Un día antes subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 18 h a 35 °C.
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 6 h a 35 °C.
B.15.6.2 Preparación de la toma de ensayo
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesar de 1 a 3 g de muestra homogénea, que contenga aproximadamente 200 µg de vitamina, añadir 50 ml de solución de ácido clorhídrico 1N en pequeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el grifo de agua corriente después de cada adición.
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 15 min a 120 °C. Enfriar.
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero aproximadamente 3 ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml mientras se enfría el matraz Erlenmeyer, y luego hidróxido de sodio 1 N. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 µg de vitamina por ml.
B.15.6.3 Solución patrón, 0,05 µg/ml
Justo antes del uso diluir la solución 16.5.5 como sigue:
| 10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml |
B.15.6.4 Medio de cultivo para el ensayo
Medio de prueba para niacina
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio actínico de 100 ml. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
| patrón: | 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml |
| cada producto: | 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml |
| + 50 a 100 ml de exceso |
B.15.6.5 Preparación del ensayo
B.15.6.5.1 Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados: bl, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:
| Tubo No.: | bl | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Solución patrón: (ml) | 0,00 | 0,00 | 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,00 | 1,50 | 2,00 | 2,50 | 3,00 |
| Agua: (ml) | 5,00 | 5,00 | 4,75 | 4,50 | 4,25 | 4,00 | 3,50 | 3,00 | 2,50 | 2,00 |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.
B.15.6.5.2 Serie producto
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18, y
así sucesivamente para todos los productos analizados.
Mediante un pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo.
| Tubo No.: | 9
| 10
| 11
| 12
| 13
|
| Solución de la muestra: | 0,25
| 0,50
| 0,75
| 1,0
| 1,50 ml
|
| Agua: | 4,75
| 4,50
| 4,25
| 4,0
| 3,50 ml
|
| Medio de cultivo: | 5
| ml
| en
| cada
| tubo
|
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.
B.15.6.6 Esterilización del ensayo
Esterilizar los tubos durante 10 min a 121 °C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.
B.15.6.7 Inoculación
B.15.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.15.6.1) a un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio coloreado.
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.15.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio (B.15.6.4). Este tubo es el inóculo.
Así pues, para una extinción del cultivo (B.15.6.1) entre 0,2 y 0,4 (después de sustraer la extinción propia del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.15.6.4). Si la extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:
| -extinción inferior a 0,2: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas). |
| -extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (B.15.6.4). |
B.15.6.7.2 Inoculación
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el medio.
B.15.6.8 Incubación
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 18 a 24 h a 35 °C. Observar los tubos con regularidad al cabo de las 16 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución de la solución patrón.
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.
B.15.6.9 Lecturas
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, dados en transferencia.
B.15.7 Cálculos
B.15.7.1 Curva de calibración
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico, o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de vitamina a la abscisa.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| µg
| lecturas
| media
|
| 1
| 2
| 3
|
| 0 | 0,00 | 0,0000 | 88,7 | 88,6 | 88,2 | 88,5 |
| 1 | 0,25 | 0,0125 | 73,4 | 72,6 | 71,1 | 72,4 |
| 2 | 0,50 | 0,0250 | 62,1 | 61,5 | 62,6 | 62,1 |
| 3 | 0,75 | 0,0375 | 53,3 | 53,2 | 55,5 | 54,0 |
| 4 | 1,00 | 0,0500 | 47,3 | 48,0 | 49,1 | 48,1 |
| 5 | 1,50 | 0,0750 | 36,8 | 37,7 | 40,5 | 38,3 |
| 6 | 2,00 | 0,1000 | 31,0 | (45,6) | 39,5 | 35,3 |
| 7 | 2,50 | 0,1250 | 30,5 | 27,2 | 27,2 | 28,3 |
| 8 | 3,00 | 0,1500 | 29,0 | 24,8 | 24,0 | 25,9 |
( )= valor aberrante
Observaciones:
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa la escala de transmisión.
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.
B.15.7.2 Contenido de vitamina en el producto
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| lecturas
| media
| µg*
| µg/ml
|
| 1
| 2
|
| 9 | 0,25 | (88,0) | 79,0 | 79,0 | 0,0070 | 0,028 |
| 10 | 0,50 | 59,2 | 58,2 | 58,7 | 0,0300 | 0,060 |
| 11 | 0,75 | 52,0 | 52,2 | 52,1 | 0,0413 | 0,055 |
| 12 | 1,00 | 43,8 | 45,8 | 44,8 | 0,0580 | 0,058 |
| 13 | 1,50 | 35,1 | 35,5 | 35,3 | 0,1000 | 0,067 |
| | | | | | Media 0,0503 = (C) |
( ) = valor aberrante
* = valores leídos en la curva de calibración
Observación:
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y la concentración en la muestra diluida.
El contenido de vitamina, expresado en mg de ácido nicotínico por 100 g de producto es igual a:
En donde:
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml
V2 = parte alícuota de V1 en ml
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml
m = toma de ensayo, en g
Ejemplo:
272 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml (V1). Se ha tomado una parte alícuota de 2 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V3).
La media de las concentraciones de niacina leídas en la curva de calibración es 0,0576 µg/ml (C).
El contenido de vitamina es:
B.16 DETERMINACION DE PIRIDOXINA (VITAMINA B6) POR METODO MICROBIOLOGICO
B.16.1 Fundamento
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de vitamina B6 utilizando Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración de Piridoxina. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio libre de Piridoxina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación en la curva se determina la concentración de la muestra.
B.16.2 Reactivos y materiales
B.16.2.1 Reactivos
Clorhidrato de Piridoxina para fines bioquímicos
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis
Cristales de cloruro de sodio para análisis
Acetato de sodio trihidratado para análisis
B.16.2.2 Materiales
Micropipeta
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml
Matraz aforado de vidrio de 100, 250 y 500 ml
Tapón de vidrio
Frascos con cápsula de polietileno a presión
Material común de laboratorio
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con aluminio.
B.16.3 Aparatos e instrumentos
Autoclave
Incubadora a 30 ± 1 °C
Espectrofotómetro
Centrífuga
B.16.4 Cepa y medios de cultivo
Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080
Agar de micro ensayo
Medio de prueba para Piridoxina
B.16.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa
Agar de microensayo
Preparar 1 l de medio según las indicaciones de la etiqueta. Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición inclinada, a fin de obtener una pendiente lo más larga posible (agar inclinado).
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.16.4.2 Mantenimiento de la cepa
Inocular por estría Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 en superficie en el medio (B.16.4.1) cada dos semanas. Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 24 h a 30 °C.
B.16.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo
Piridoxina y medio para prueba, solución 1:1, enriquecida con 1 ng de vitamina B6/ml.
Diluir 1 ml de solución patrón B.16.5.7 a 100 ml. Añadir 1 ml de esta dilución a 500 ml de medio de cultivo B.16.6.4 y completar a 1 l con agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.16.5 Preparación de soluciones
B.16.5.1 Solución fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121 °C.
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.16.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 0,44 N
Bajo una campana de extracción diluir 36,5 ml de ácido clorhídrico al 37% a 100 ml con agua destilada. Para ello verter el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.
B.16.5.3 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 0,055 N
Bajo una campana de extracción diluir 4,5 ml de ácido clorhídrico al 37% a 1000 ml con agua destilada. Para ello verter el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.
B.16.5.4 Solución de hidróxido de sodio, 60 g/100 ml
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500 ml en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de goma.
B.16.5.5 Solución de hidróxido de sodio aproximadamente 1 N
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml con tapón de polietileno.
B.16.5.6 Solución de acetato de sodio aproximadamente 2,5 M
En un matraz aforado de 500 ml disolver 170 g de acetato de sodio trihidratado en agua destilada y llevar a volumen.
B.16.5.7 Solución patrón
Pesar exactamente 50,0 mg de piridoxina; disolver en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml. Conservar esta solución congelada en fracciones de 5 ml durante máximo 6 meses.
B.16.6 Procedimiento
La vitamina B6 es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se debe utilizar material actínico o cubrir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o paño negro.
B.16.6.1 Desarrollo del microorganismo
Tres días antes de la inoculación del ensayo, efectuar dos cultivos sucesivos de 24 h en superficies de agar. Un día antes del ensayo, subcultivar el microorganismo tomado del último cultivo sobre agar, en un tubo del medio líquido B.16.4.3.
Incubar durante 24 h a 30 °C.
B.16.6.2 Preparación de la toma de ensayo
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, pesar de 1 a 2 g de muestra homogénea, que contenga por lo menos 2 µg de vitamina. Poner en suspensión en 180 ml de:
Solución de ácido clorhídrico 0,44 N si el producto contiene almidón.
Solución de ácido clorhídrico 0,055 N si el producto no contiene almidón.
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 1 h a 125 °C. Enfriar.
Después de enfriar añadir:
3 ml de solución de hidróxido de sodio (B.16.5.4) si el producto contiene almidón.
8 ml de solución de acetato de sodio (B.16.5.6) si el producto no contiene almidón.
Ajustar el pH a 4,6 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 5 ng de vitamina por ml.
B.16.6.3 Solución patrón, 5 ng/ml
Justo antes del uso diluir la solución B.10.5.7 como sigue:
B.16.6.4 Medio de cultivo para el ensayo
Medio Y para prueba de piridoxina
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
| patrón: | 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml |
| cada producto: | 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml |
| + 50 a 100 ml de exceso |
B.16.6.5 Preparación del ensayo
B.16.6.5.1 Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensayo, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:
| Tubo No.: bl | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Solución patrón: 0,0 | 0,0 | 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3,0 ml |
| Agua: 5 | 5 | 4,75 | 4,5 | 4,25 | 4,0 | 3,5 | 3,0 | 2,5 | 2 ml |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.
B.16.6.5.2 Serie producto
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y así sucesivamente para todos los productos analizados.
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo.
| Tubo No.: 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| Solución de la muestra: 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,50 ml |
| Agua: 4,75 | 4,50 | 4,25 | 4,0 | 3,50 ml |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.
B.16.6.6 Esterilización del ensayo
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115 °C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.
B.16.6.7 Inoculación
B.16.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.16.4.1) a un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 1000 rpm durante 2 min. Decantar la solución y lavar el sedimento 3 veces con 10 ml de solución fisiológica estéril, centrifugando y decantando la solución después de cada lavado.
Suspender el sedimento en 5 ml de solución fisiológica. Diluir de 3 a 4 gotas de esta suspensión en un tubo que contenga 10 ml de solución fisiológica. Este tubo es el inóculo.
B.16.6.7.2 Inoculación
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el medio.
B.16.6.8 Incubación
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 19 h a 30 °C. Dado que Saccharomyces carlsbergensis es aerobio, inclinar los tubos al máximo a fin de que la superficie de contacto entre el líquido y el aire sea la mayor posible.
Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución de la solución patrón.
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.
B.16.6.9 Lecturas
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, dados en transmitancia.
B.16.7 Cálculos
B.16.7.1 Curva de calibración
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de vitamina a la abscisa.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| µg
| lecturas
| media
|
| 1
| 2
| 3
|
| 0 | 0,0 | 0,0 | 91,2 | 90,6 | 90,5 | 90,7 |
| 1 | 0,25 | 1,25 | 70,4 | 70,0 | 70,2 | 70,2 |
| 2 | 0,50 | 2,5 | 51,5 | 54,6 | 55,5 | 53,9 |
| 3 | 0,75 | 3,75 | 42,2 | 44,4 | 44,5 | 43,7 |
| 4 | 1,0 | 5,0 | 33,8 | 33,2 | 34,5 | 33,8 |
| 5 | 1,5 | 7,5 | 23,2 | 24,3 | 26,0 | 24,5 |
| 6 | 2 | 10 | 20,0 | 18,5 | 19,2 | 19,2 |
| 7 | 2,5 | 12,5 | 15,1 | 15,2 | 15,7 | 15,3 |
| 8 | 3,0 | 15,0 | 14,2 | 13,2 | 13,2 | 13,5 |
Observaciones:
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa de la escala de transmisión.
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.
B.16.7.2 Contenido de vitamina en el producto
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| lecturas
| media
| µg*
| µg/ml
|
| 1
| 2
|
| 9 | 0,25 | (80) | 68,3 | 68,3 | 1,20 | 4,78 |
| 10 | 0,50 | 51,5 | 54,5 | 53,0 | 2,435 | 4,85 |
| 11 | 0,75 | 43,5 | 41,1 | 42,3 | 3,615 | 4,81 |
| 12 | 1 | 34,9 | 33,7 | 34,3 | 4,95 | 4,95 |
| 13 | 1,5 | 23,9 | 25,1 | 24,5 | 7,47 | 4,987 |
Media 4,87 =(C)
( ) = valor aberrante
* = valores leídos en la curva de calibración
Observación:
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y la concentración en la muestra diluida.
El contenido de vitamina, expresado en mg de clorhidrato de piridoxina por 100 g de producto es igual a:
En donde:
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml
V2 = parte alícuota de V1 en ml
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml
m = toma de ensayo, en g
Ejemplo:
232 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 250 ml (V1). Se ha tomado una parte alícuota de 10 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V3).
La media de las concentraciones de piridoxina leídas en la curva de calibración es 4,87 ng/ml (C).
El contenido de vitamina es:
B.17 DETERMINACION DE ACIDO FOLICO (VITAMINA B9) POR METODO MICROBIOLOGICO
B.17.1 Fundamento
Este método permite cuantificar ácido fólico utilizando Lactobacillus casei ATCC 7469, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración de folato presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio comercial libre de folato. El crecimiento celular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se determina la concentración en la muestra.
B.17.2 Reactivos y materiales
B.17.2.1 Reactivos
Cloruro de calcio fundido o granulado para análisis
Fosfato diácido de potasio anhidro
Fosfato ácido di-potásico anhidro
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis
Cristales de cloruro de sodio para análisis
Alcohol etílico absoluto
a-amilasa
Lactosa
B.17.2.2 Materiales
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml
Matraz aforado de vidrio de 100, 250 y 500 ml
Tapones de vidrio
Micropipetas
Material común de laboratorio
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.
B.17.3 Aparatos e instrumentos
Autoclave
Incubadora a 35 ± 1 °C
Espectrofotómetro
Centrífuga
B.17.4 Cepa y medios de cultivo
Lactobacillus casei ATCC 7469
Leche descremada en polvo grado reactivo
Caldo Micro Inoculum
Agar bacteriológico
Caldo Bacto Lactobacilli MRS
Medio de prueba para ácido fólico
B.17.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar)
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según las indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición vertical.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.17.4.2 Mantenimiento de la cepa
Inocular por punción Lactobacillus casei en profundidad en el medio (B.17.4.1) cada cuatro semanas, efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido (B.17.4.3). Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 18 h a 35 °C.
B.17.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo
Caldo Micro Inoculum
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.17.5 Preparación de soluciones
B.17.5.1 Solución fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1 000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121 °C.
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.17.5.2 Solución tampón pH 6,1
Disolver 2 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml con tapón de polietileno.
B.17.5.3 Solución de cloruro de calcio, CaCl2, al 2%
Disolver 2 g de cloruro de calcio en agua destilada y completar a 100 ml en un matraz aforado.
B.17.5.4 Solución patrón
Pesar exactamente 50,0 mg de ácido fólico (ácido pteroilglutámico), disolver en agua destilada en un matraz aforado de vidrio de 500 ml, añadir 50 ml de NaOH 0,1 N, 100 ml de alcohol y llevar a volumen con
agua destilada.
Conservar esta solución a 4 °C durante máximo 6 meses.
B.17.6 Procedimiento
El ácido fólico es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se debe utilizar material de vidrio actínico o cubrir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o un paño negro.
B.17.6.1 Desarrollo del microorganismo
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (B.17.4.3).
Incubar durante 18 h a 35 °C.
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 6 h a 35 °C.
B.17.6.2 Preparación de la toma de ensayo
B.17.6.2.1 Productos sin almidón
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, pesar de 1 a 3 g de muestra homogénea, que contenga aproximadamente 1 µg de ácido fólico. Disolver en 30 ml de solución tampón pH 6,1 (B.17.5.2). A fin de evitar la formación de grumos, añadir la solución tampón en pequeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el grifo de agua caliente.
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en el autoclave durante 20 min a 102 °C. Enfriar.
Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de vidrio de 100 ml. Añadir al contenido del matraz 0,8 ml de solución de cloruro de calcio al 2% y agitar. Dejar reposar durante 15 min, luego llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,2 ng de ácido fólico por ml.
B.17.6.2.2 Productos con almidón
Proceder según el primer apartado bajo (B.17.6.2.1).
Antes de colocar la solución en el autoclave, añadir una cantidad de mezcla al 6% de a-amilasa pancreática en lactosa, correspondiente a 1% de la toma de ensayo.
Incubar durante 30 min a 42 °C. Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en el autoclave durante 20 min a 102 °C. Enfriar. A continuación transferir cuantitativamente a un matraz aforado de vidrio de 100 ml y proseguir como se describe en (B.17.6.2.1)
Nota: Con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco.
Mediante una pipeta tomar 10 ml de solución patrón (B.17.6.3) dilución d. Añadir 30 ml de agua. Añadir 100 mg de mezcla al 6% de a-amilasa pancreática en lactosa. Incubar durante 30 min a 42 °C. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Llevar a volumen y filtrar.
La curva de calibración obtenida con esta solución debe ser comparable a aquella obtenida con la solución patrón no tratada.
B.17.6.3 Solución patrón 0,2 ng/ml
Justo antes del uso diluir la solución 18.5.4 como sigue:
| 10 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml |
B.17.6.4 Medio de cultivo para el ensayo
Medio para prueba de ácido fólico.
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
| patrón: | 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml |
| cada producto: | 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml |
| + 50 ml a 100 ml de exceso |
B.17.6.5 Preparación del ensayo
B.17.6.5.1 Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 0,..., 8; el primero corresponde al blanco.
Mediante una pipeta vertir en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:
| Tubo No.: bl | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Solución patrón: 0,0 | 0,0 | 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3,0 ml |
| Agua: 5 | 5 | 4,75 | 4,5 | 4,25 | 4,0 | 3,5 | 3,0 | 2,5 | 2 ml |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.
B.17.6.5.2 Serie producto
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y así sucesivamente para todos los productos analizados.
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo.
| Tubo No.: 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| Solución de la muestra: 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,50 ml |
| Agua: 4,75 | 4,50 | 4,25 | 4,0 | 3,50 ml |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.
B.17.6.6 Esterilización del ensayo
Esterilizar los tubos durante 10 min a 121 °C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.
B.17.6.7 Inoculación
B.17.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.17.6.1) a un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio coloreado.
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.17.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio (B.17.6.4). Este tubo es el inóculo.
Así pues, para una extinción del cultivo (B.17.6.1) entre 0,40 y 0,60 (después de sustraer la extinción propia del medio), introducir 5 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.17.6.4). Si la extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:
| - extinción inferior a 0,40: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas) |
| - extinción superior a 0,60: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (B.17.6.4). |
B.17.6.7.2 Inoculación
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el medio.
B.17.6.8 Incubación
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 19 h a 35 °C. Observar los tubos con regularidad al cabo de las 19 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución de la solución patrón.
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.
B.17.6.9 Lecturas
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.
B.17.7 Cálculos
B.17.7.1 Curva de calibración
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o mediante una calculadora con regresión lineal, llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de ácido fólico a la abscisa.
*Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, dados en transmitancia.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| µg
| lecturas
| media
|
| 1
| 2
| 3
|
| 0 | 0,0 | 0,0 | 88,1 | 87,6 | 87,5 | 87,7 |
| 1 | 0,25 | 0,05 | 78,4 | 78,5 | 79,5 | 78,8 |
| 2 | 0,50 | 0,1 | 70,5 | 70,4 | 71,3 | 70,7 |
| 3 | 0,75 | 0,15 | 64,1 | 64,6 | 64,6 | 64,4 |
| 4 | 1,0 | 0,20 | 58,9 | 59,6 | 59,3 | 59,3 |
| 5 | 1,5 | 0,30 | 50,8 | 51,3 | 51,4 | 51,2 |
| 6 | 2 | 0,40 | 44,7 | 44,1 | 45,5 | 44,8 |
| 7 | 2,5 | 0,50 | 39,7 | 39,7 | 38,2 | 39,2 |
| 8 | 3,0 | 0,60 | 35,6 | 36,1 | 35,2 | 35,6 |
Observaciones:
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa de la escala de transmisión.
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.
B.17.7.2 Contenido de vitamina en el producto
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| lecturas
| media
| µg*
| µg/ml
|
| 1
| 2
|
| 9 | 0,25 | 80,2 | 79,4 | 79,8 | 0,045 | 0,18 |
| 10 | 0,50 | 71,6 | 73,7 | 72,6 | 0,095 | 0,19 |
| 11 | 0,75 | 66,1 | 67,7 | 66,9 | 0,135 | 0,18 |
| 12 | 1 | 61,4 | (56,5) | 61,4 | 0,185 | 0,185 |
| 13 | 1,5 | 53,7 | 52,1 | 52,9 | 0,280 | 0,187 |
Media 0,184 (=C)
( ) = valor aberrante
* = valores leídos en la curva de calibración
Observación:
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y la concentración en la muestra diluida.
El contenido de ácido fólico, expresado en µg/100 g de producto es igual a:
En donde:
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml
V2 = parte alícuota de V1, en ml
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml
m = toma de ensayo, en g
Ejemplo:
1 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml(V1). Se ha tomado una parte alícuota de 10 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de 250 ml (V3).
La media de las concentraciones en ácido fólico leídas en la curva de calibración es 0,184 ng/ml (C).
El contenido en ácido fólico es:
B.18 DETERMINACION DE PANTOTENATO DE CALCIO POR METODO MICROBIOLOGICO
B.18.1 Fundamento
Este método permite cuantificar pantotenato de calcio utilizando un microorganismo que no es capaz de sintetizarlo (Lactobacillus plantarum ATCC 8014); el crecimiento celular se relaciona directamente con la concentración de pantotenato presente.
Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio basal libre de pantotenato. El crecimiento celular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se determina la concentración de la muestra.
B.18.2 Reactivos y materiales
B.18.2.1 Reactivos
Leche descremada en polvo grado reactivo
Calcio D(+) pantotenato para fines bioquímicos
Acido acético glacial 100% para análisis
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis
Cristales de cloruro de sodio para análisis
Papaína
Diastasa
B.18.2.2 Materiales
Mortero de porcelana, interior esmaltado, diámetro 80 mm.
Pistilo de porcelana, cabeza esmaltada, longitud 75-80 mm (serruchado, si es demasiado largo)
Probeta graduada de 100 ml
Material común de laboratorio
B.18.3 Aparatos e instrumentos
Autoclave
Incubadora a 35 ± 1 °C
Espectrofotómetro
Micropipeta
Centrífuga
B.18.4 Cepa y medios de cultivo
Lactobacillus plantarum, ATCC 8014
Caldo Micro Inoculum
Agar bacteriológico
Caldo Bacto Lactobacilli MRS
Medio de prueba para pantotenato
B.18.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar)
Preparar 1 l de medio de agar bacteriológico con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g agar bacteriológico, según las indicaciones de la etiqueta del caldo MRS+1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y
enfriar en posición vertical.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.18.4.2 Mantenimiento de la cepa
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el medio (B.18.4.1) cada cuatro semanas, efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido B.18.4.3. Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 18 h a 35 °C.
B.18.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo
Caldo micro Inoculum
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.18.5 Preparación de soluciones
B.18.5.1 Solución fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121 °C.
Conservar en el refrigerador a 4 °C.
B.18.5.2 Solución de ácido acético aproximadamente 1 N
Diluir 29 ml de ácido acético glacial en 500 ml con agua destilada.
B.18.5.3 Solución de hidróxido de sodio, aproximadamente 1 N
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml con tapón de polietileno.
B.18.5.4 Solución tampón pH 4,6
En un matraz aforado de 500 ml, mezclar 100 ml de ácido acético 1 N con 50 ml de hidróxido de sodio (B.17.5.3) y llevar a volumen con agua destilada.
B.18.5.5 Solución patrón
Justo antes del uso, pesar exactamente 50,0 mg de pantotenato de calcio; disolver en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml.
B.18.6 Procedimiento
B.18.6.1 Desarrollo del microorganismo
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (B.18.4.3).
Incubar durante 18 a 24 h a 35 °C.
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 6 h a 35 °C.
B.18.6.2 Preparación de la toma de ensayo
Próximo a la determinación, pesar en pequeños morteros de porcelana de 1-2 g de muestra homogénea, que contenga aproximadamente 50 µg de pantotenato de calcio. Añadir 100 mg de papaína y 50 mg de diastasa. Moler todo cuidadosamente mediante el pistilo.
Mojar la mezcla con 10 ml de solución tampón pH 4,6 (B.18.5.4). Cubrir los morteros y los pistilos con papel de aluminio y a continuación colocarlos en una estufa.
Incubar una noche a 42 °C.
Después de la incubación, verificar el pH y ajustarlo a 4,6 si es necesario. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 µg de pantotenato de calcio por ml.
Observación: Con cada nuevo lote de diastasa y de papaína, efectuar un ensayo en blanco:
Tratar 5 g de papaína o de diastasa como la toma de ensayo. Sin diluir, proceder según (B.18.6.5.2). El contenido de pantotenato de calcio de la enzima no debe rebasar 1 mg/100 g.
B.18.6.3 Solución patrón, 0,05 µg/ml
Justo antes del uso diluir la solución 17.5.5 como sigue:
| 10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml
|
B.18.6.4 Medio de cultivo para el ensayo
Medio de prueba para pantotenato.
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
| patrón: | 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml |
| cada producto: | 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml |
| + 50 a 100 ml de exceso |
B.18.6.5 Preparación del ensayo
B.18.6.5.1 Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa automática añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:
| Tubo No.: bl | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Solución Patrón: 0,0 | 0,0 | 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3,0 ml |
| Agua: 5 | 5 | 4,75 | 4,5 | 4,25 | 4,0 | 3,5 | 3,0 | 2,5 | 2 ml |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.
B.18.6.5.2 Serie producto
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y así sucesivamente para todos los productos analizados.
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de
cultivo para el ensayo.
| Tubo No.: 9 | 10
| 11
| 12
| 13
|
| Solución de la muestra: 0,25 | 0,50
| 4,75
| 1,0
| 1,50 ml
|
| Agua: 4,75 | 4,50
| 4,25
| 4,0
| 3,50 ml
|
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.
Esterilizar los tubos durante 15 min a 115 °C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.
B.18.6.6 Inoculación
B.18.6.6.1 Preparación y estandarización del inóculo
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.18.6.1) a un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio coloreado.
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.18.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio (B.18.6.4). Este tubo es el inóculo.
Así pues, para una extinción del cultivo (B.18.6.1) entre 0,2 y 0,4 (después de sustraer la extinción propia del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.18.6.4). Si la extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:
| - extinción inferior a 0,2: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas). |
| - extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (B.18.6.4). |
B.18.6.6.2 Inoculación
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el medio.
B.18.6.7 Incubación
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 16 h a 35 °C. Observar los tubos con regularidad al cabo de las 16 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución de la solución patrón.
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.
B.18.6.8 Lecturas
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl). *
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia, buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, dados en transmitancia.
B.18.7 Cálculos
B.18.7.1 Curva de calibración
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico, o mediante una calculadora con regresión lineal
llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de pantotenato de calcio a la abscisa.
Ejemplo:
| Tubo No.
| ml
| µg
| lecturas
| media
|
| 1
| 2
| 3
|
| 0 | 0,0 | 0,0 | 99,0 | 98,9 | 99,7 | 99,2 |
| 1 | 0,25 | 0,0125 | 93,0 | 92,2 | 91,0 | 92 |
| 2 | 0,50 | 0,025 | 82,8 | 83,3 | 82,9 | 83,0 |
| 3 | 0,75 | 0,0375 | 72,3 | 70,2 | 73,0 | 71,8 |
| 4 | 1,0 | 0,050 | 57,4 | 58,9 | 64,2 | 60,1 |
| 5 | 1,5 | 0,075 | 39,8 | 36,5 | 39,8 | 38,7 |
| 6 | 2 | 0,100 | 26,9 | 27,0 | 27,2 | 27,0 |
| 7 | 2,5 | 0,125 | 22,4 | 20,2 | 21,0 | 21,2 |
| 8 | 3,0 | 0,150 | 18,9 | 17,1 | 18,9 | 18,3 |
Observaciones:
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa de la escala de transmisión.
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.
B.18.7.2 Contenido de vitamina en el producto
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.
Ejemplo:
| Tubo No.
| ml
| lecturas
| media
| µg*
| µg/ml
|
| 1
| 2
|
| 9 | 0,25 | (81) | 92,1 | 92,1 | 0,0119 | 0,0476 |
| 10 | 0,50 | 82,7 | 81,7 | 82,2 | 0,0252 | 0,0504 |
| 11 | 0,75 | 71,4 | 72,2 | 71,8 | 0,038 | 0,0507 |
| 12 | 1 | 57,2 | 58,8 | 58,0 | 0,050 | 0,0500 |
| 13 | 1,5 | 37,9 | 39,1 | 38,5 | 0,076 | 0,0507 |
Media 0,0498(=C)
( ) = valor aberrante
* = valores leídos en la curva de calibración
Observación:
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y la concentración en la muestra diluida.
El contenido de pantotenato de calcio expresado en mg/100 g de producto es igual a:
En donde:
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml
V2 = parte alícuota de V1, en ml
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml
m = toma de ensayo, en g
Ejemplo:
1,127 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml(V1). Se ha tomado una parte alícuota de 10 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V3).
La media de las concentraciones de pantotenato de calcio leídas en la curva de calibración es 0,0498 µg/ml (C).
El contenido de pantotenato de calcio es:
B.19 DETERMINACION DE CIANOCOBALAMINA (VITAMINA B12) POR METODO MICROBIOLOGICO
B.19.1 Fundamento
Este método permite cuantificar cianocobalamina utilizando Lactobacillus leichmannii ATCC 7830, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración de cianocobalamina presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio comercial libre de cianocobalamina. El crecimiento celular se mide turbimétricamente y por interpolación en la curva se determina la concentración de la muestra. El análisis debe realizarse con baja intensidad de luz porque la vitamina B12 es fotosensible.
B.19.2 Reactivos y materiales
B.19.2.1 Reactivos
Vitamina B12 para fines bioquímicos
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis
Cianuro de sodio (CN) para análisis
Cristales de cloruro de sodio para análisis
Hipoclorito de sodio
Diastasa
B.19.2.2 Materiales
Micropipetas
Centrífuga
Matraz en forma de pera de vidrio de 100 ml
Matraz aforado de vidrio de 100 y 500 ml
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml
Baño de agua
Refrigerante Allihn
Frascos con cápsula de polietileno a presión de 8 ml
Tapón de vidrio
Pera de goma, propipeta
Material común de laboratorio
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.
B.19.3 Aparatos e instrumentos
Autoclave
Incubadora a 35 ± 1 °C
Espectrofotómetro
B.19.4 Cepa y medios de cultivo
Lactobacillus leichmannii ATCC 7830
Leche descremada en polvo grado reactivo
Caldo micro inoculum
Agar bacteriológico
Caldo Bacto Lactobacilli MRS
Medio de prueba para vitamina B12
B.19.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar)
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según las indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición vertical.
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.19.4.2 Mantenimiento de la cepa
Inocular por punción Lactobacillus leichmannii en profundidad en el medio (B.19.4.1) cada cuatro semanas, efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido (B.19.4.3). Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 18 h a 35 °C.
B.19.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo
Caldo Micro Inoculum
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.19.5 Preparación de soluciones
B.19.5.1 Solución fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121 °C.
Conservar en el refrigerador 2 a 8 °C.
B.19.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 1 N
Bajo una campana de extracción diluir 82 ml de ácido clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de 1000 ml con agua destilada, para ello vertir el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.
B.19.5.3 Solución de cianuro de sodio, 10 g /100 ml
CUIDADO: VENENO. UTILIZAR GUANTES.
En un matraz aforado de 100 ml disolver 10 g de cianuro de sodio en agua destilada y llevar a volumen.
Conservar en el refrigerador 2 a 8 °C.
B.19.5.4 Solución de cianuro de sodio al 1%
Justo antes del uso, tomar mediante una pipeta y una pera de goma, 1/ml de solución de cianuro de sodio (B.19.5.3) y diluir a 10 ml con agua destilada en un matraz aforado de 10 ml.
Nota: La solución sobrante de cianuro de sodio al 1% debe destruirse mediante adición de solución de hipoclorito de sodio al 15% (aproximadamente 1 ml por 10 ml de solución de cianuro de sodio). Dejar reaccionar durante 2 días bajo una campana de extracción.
B.19.5.5 Solución patrón
Pesar exactamente 50,0 mg de vitamina B12; disolver en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de vidrio de 500 ml. Verificar la concentración de la solución como sigue:
Diluir 1 ml de solución con 3 ml de agua destilada. Medir la extinción de dicha solución en una cubeta de 1 cm a 360 nm.
En donde:
f = contenido de vitamina B12, en %
E = extinción leída
Corregir la concentración de la solución proporcionalmente según el ejemplo:
para f = 76
Eliminar la solución si el valor de f es inferior a 70%
Conservar esta solución congelada en porciones de 5 ml en matraces actínicos durante máximo 6 meses.
B.19.6 Procedimiento
La vitamina B12 es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se debe utilizar material de vidrio actínico o cubrir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o un paño negro.
B.19.6.1 Desarrollo del microorganismo
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (B.19.4.3).
Incubar durante 18 h a 35 °C.
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 18 a 24 h a 35 °C.
B.19.6.2 Preparación de la toma de ensayo
En un matraz de 100 ml con esmerilado normalizado, pesar de 3 a 4 g de muestra homogénea, que contenga aproximadamente 100 ng de vitamina B12.
Disolver la toma de ensayo en 25 ml de agua destilada a 50 °C. A fin de evitar la formación de grumos, añadir el agua destilada en pequeñas cantidades agitando cada vez.
Añadir 0,2 ml de solución de cianuro de sodio (B.19.5.4) recién preparada (CUIDADO: VENENO) y agitar.
Dejar la solución durante 30 min a temperatura ambiente, al abrigo de la luz y agitar de vez en cuando. Al cabo de este tiempo, ajustar el pH de 4,8 - 5 con solución de ácido clorhídrico 1 N. A continuación calentar el matraz durante 35 min en un baño de agua en ebullición. Enfriar (*). Ajustar el pH a 4,6. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.
* Para productos con almidón se recomienda aplicar un tratamiento enzimático a fin de obtener un filtrado límpido. Añadir a la solución la cantidad de diastasa equivalente al 10% de la toma de ensayo. Incubar durante 30 min a 42 °C.
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 ng de vitamina B12/ml.
Nota: con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco.
Tratar 3 g de diastasa como la toma de ensayo. El contenido de vitamina B12 de la diastasa no debe rebasar 0,5 µg/100 g.
B.19.6.3 Solución patrón 0,05 ng/ml
Justo antes del uso diluir la solución (B.19.5.5) como sigue:
| 2 ml* a 100 ml = 0,05 ng/ml |
* + 0,2 ml de cianuro de sodio (CUIDADO VENENO)
B.19.6.4 Medio de cultivo para el ensayo
Medio para prueba de vitamina B12
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
| patrón: | 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml |
| cada producto: | 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml |
| + 50 ml a 100 ml de exceso |
B.19.6.5 Preparación del ensayo
B.19.6.5.1 Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 0,..., 8; el primero corresponde al blanco.
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:
| Tubo No.: bl | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Solución patrón: 0,0 | 0,0 | 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3,0 ml |
| Agua: 5 | 5 | 4,75 | 4,5 | 4,25 | 4,0 | 3,5 | 3,0 | 2,5 | 2 ml |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.
B.19.6.5.2 Serie producto
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18, y así sucesivamente para todos los productos analizados.
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo.
| Tubo No.: 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| Solución de la muestra: 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,50 ml |
| Agua: 4,75 | 4,50 | 4,25 | 4,0 | 3,50 ml |
| Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo |
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.
B.19.6.6 Esterilización del ensayo
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115 °C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.
B.19.6.7 Inoculación
B.19.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.19.6.1) a un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio coloreado.
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.19.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio (B.19.6.4). Este tubo es el inóculo.
Así pues, para una extinción del cultivo (B.19.6.1) entre 1,10 y 1,25 (después de sustraer la extinción propia del medio), introducir 2 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.19.6.4). Si la extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:
| -extinción inferior a 1,10: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 3 gotas) |
| -extinción superior a 1,25: diluir proporcionalmente con el medio (B.19.6.4). |
B.19.6.7.2 Inoculación
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el medio.
B.19.6.8 Incubación
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 18 a 24 h a 35 °C. Observar los tubos con regularidad al cabo de las 14 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución de la solución patrón.
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.
B.19.6.9 Lecturas
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl). *
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, dados en transmitancia.
B.19.7 Cálculos
B.19.7.1 Curva de calibración
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o mediante una calculadora con regresión lineal, llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los ng de vitamina B12 a la abscisa.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| µg
| lecturas
| media
|
| 1
| 2
| 3
|
| 0 | 0,0 | 0,0 | 95,1 | 95,0 | 95,1 | 95,0 |
| 1 | 0,25 | 0,0125 | 82,2 | 80,9 | 82,4 | 81,8 |
| 2 | 0,50 | 0,025 | 67,5 | 67,0 | 66,1 | 66,9 |
| 3 | 0,75 | 0,0375 | 55,0 | 56,5 | 57,5 | 56,3 |
| 4 | 1,0 | 0,050 | 48,5 | 48,9 | 47,2 | 48,2 |
| 5 | 1,5 | 0,075 | 37,1 | 37,8 | 36,8 | 37,2 |
| 6 | 2 | 0,100 | 30,5 | 30,5 | 30,3 | 30,4 |
| 7 | 2,5 | 0,125 | 25,4 | 23,2 | 24,4 | 24,3 |
| 8 | 3,0 | 0,150 | 20,2 | 21,2 | 20,0 | 20,5 |
Observaciones:
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa de la escala de transmisión.
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.
B.19.7.2 Contenido de vitamina en el producto
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.
Ejemplo:
| Tubo
No.
| ml
| lecturas
| media
| µg*
| µg/ml
|
| 1
| 2
|
| 9 | 0,25 | (93) | 81,8 | 81,8 | 0,0131 | 0,0524 |
| 10 | 0,50 | 66,1 | 65,3 | 65,7 | 0,0263 | 0,0526 |
| 11 | 0,75 | 54,8 | 56,8 | 55,8 | 0,038 | 0,0507 |
| 12 | 1 | 48,5 | 48,1 | 48,3 | 0,049 | 0,0490 |
| 13 | 1,5 | 37 | 38 | 37,5 | 0,077 | 0,0513 |
Media 0,0512(=C)
( ) = valor aberrante
* = valores leídos en la curva de calibración
Observación:
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y la concentración en la muestra diluida.
El contenido de vitamina B12, expresado en µg/100 g de producto es igual a:
En donde:
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml
V2 = parte alícuota de V1, en ml
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml
m = toma de ensayo, en g
Ejemplo:
246 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml (V1). Se ha tomado una parte alícuota de 20 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V3).
La media de las concentraciones en vitamina B12 leídas en la curva de calibración es 0,0512 ng/ml (C).
El contenido en vitamina B12 es:
B.20 DETERMINACION DE VITAMINA K1 POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
B.20.1 Fundamento
Se extrae la fracción liposoluble de una muestra en un tubo de centrífuga o mediante una columna de tierra de infusorios. Se separan las grasas en una columna HPLC preparativa y se recoge la fracción que contiene la vitamina K1. Se inyecta esta fracción en una columna HPLC analítica y se determina el contenido de vitamina K1 mediante un detector espectrofotométrico.
B.20.2 Reactivos y materiales
B.20.2.1
Dimetilsulfóxido (DNSO) para síntesis
Alcohol etílico absoluto para análisis
n-Hexano grado purísimo
Isooctano para análisis
Acetonitrilo para cromatografía
Vitamina K1
Pirogalol para análisis
Diclorometano para cromatografía
Papaína soluble
Tetrahidrofurano para análisis
20 columnas preparadas para extracción de sustancias lipófilas de soluciones acuosas
Envase de repuesto para 50 rellenos de la columna
Diastasa
B.20.2.2 Materiales
Tubos para centrífuga de vidrio de 40 ml
Tapones huecos hexagonales de diferentes medidas
Matraces en forma de pera de 10 ml
Matraces en forma de pera de vidrio de 25 y 250 ml
Pipetas graduadas hasta la punta de 1 ml: 0,005; 5 ml: 0,05; 10 ml: 0,10 y 20 ml: 0,10
Micromatraz aforado de precisión de 2 ml
Matraces aforados de vidrio de 10, 50 y 100 ml
Filtro con poro de 0,45 µm
Nota: Utilizar material de vidrio actínico cuidadosamente lavado, con el fin de evitar que sea fuente de contaminación.
B.20.3 Aparatos e instrumentos
Jeringuilla para HPLC de 1 ml y de aguja intercambiable
Aguja para jeringuilla de HPLC
Cilindro para gas comprimido, N2
Manodentor para gas comprimido, N2
Agitador para tubos de ensaye
Estufa de laboratorio
Instalación de HPLC que consta de:
Para cromatografía preparativa: una bomba, un inyector (loop de 500 µl), una columna preparativa, un detector de longitud de onda variable, un registrador para cromatografía analítica: una bomba, un inyector (loop de 100 µl), una columna analítica, un detector de longitud de onda variable, un registrador.
Para una determinación por día, basta con un detector de longitud de onda variable y un solo registrador para ambos sistemas.
Balanza de precisión
Balanza analítica, 162 g; 0,1 mg
Centrífuga
Placa con pinzas para tubos de centrífuga
Mesa vibrante, movimiento alternante
Baño ultrasónico
B.20.4 Preparación de soluciones
B.20.4.1 Solución de pirogalol de 1 g/100 ml
El día de la determinación disolver en un matraz aforado de 25 ml, 250 mg de pirogalol en alcohol etílico.
B.20.4.2 Fase móvil para HPLC preparativa: 1% de acetato de etilo en isooctano.
En un matraz aforado de 1 000 ml, mezclar 10 ml de acetato de etilo con isooctano previamente degasificado bajo presión reducida y filtrado. Llevar a volumen.
B.20.4.3 Fase móvil para purificar la columna preparativa: 10% de acetato de etilo en isooctano.
En un matraz aforado de 500 ml, mezclar 50 ml de acetato de etilo con isooctano previamente degasificado bajo presión reducida y filtrado. Llevar a volumen.
B.20.4.4 Fase móvil para HPLC analítica: acetonitrilo-diclorometano-propanol-2 89:10:1 v/v/v
Degasificar 1 litro de acetonitrilo bajo presión reducida y filtrar sobre una membrana.
En un matraz aforado de 1 000 ml, mezclar 100 ml de diclorometano y 10 ml de propanol-2 con acetonitrilo y llevar a volumen.
B.20.4.5 Soluciones patrón de vitamina K1
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 40 mg de vitamina K1 (fitomenadiona). Disolver y llevar a volumen con n-hexano. Esta es la solución 1 de 0,40 mg/ml. Se conserva una semana a 4 °C.
Justo antes de la determinación, efectuar las diluciones siguientes con n-hexano:
Solución 2: diluir 5 ml de solución 1 en un matraz aforado de 50 ml (40 µg/ml).
Solución 3: diluir 5 ml de solución 2 en un matraz aforado de 50 ml (4 µg/ml). Determinar la concentración exacta de vitamina K1 midiendo la extinción (E) a 248 nm.
| E1% en n-hexano = 435 |
| 1 cm |
Solución 4: diluir 5 ml de solución 3 en un matraz aforado de 50 ml (0,4 µg/ml). Utilizar esta solución como patrón en la cromatografía preparativa para determinar el tiempo de retención.
Solución 5: Mediante una pipeta, vertir 1 ml de solución 3 en un matraz aforado de 10 ml; evaporar a sequedad el disolvente bajo una ligera corriente de nitrógeno. Disolver y llevar a volumen con la fase móvil (B.23.4.4). Utilizar esta solución (0,4 µg/ml) como patrón en la cromatografía analítica.
B.20.5 Procedimiento
B.20.5.1 Preparación de la toma de ensayo
B.20.5.1.1 Extracción en tubos de centrífuga
B.20.5.1.1.1 Productos sólidos
Pesar 20 g de producto en un matraz aforado de 100 ml. Añadir 50 ml de agua a 45 °C, luego 0,1 g de diastasa; a continuación, incubar durante 20 min a 40 °C. Introducir 0,1 g de papaína e incubar de nuevo durante 20 min a 40 °C. Llevar a volumen con agua a temperatura ambiente. La suspensión debe ser homogénea; si no, colocar el matraz en un baño ultrasónico durante unos 5 min. Tomar 5 ml de suspensión e introducir en un tubo de centrífuga de vidrio provisto de un esmerilado. Añadir 10 ml de dimetilsulfóxido y mezclar. Introducir 5 ml de solución de pirogalol y agitar. Luego añadir 10 ml de n-hexano y agitar el tubo vigorosamente durante 10 min mediante una mesa vibrante. Centrifugar el tubo, a fin de separar las dos fases líquidas.
Transferir la fase superior a otro tubo de centrífuga.
Añadir 10 ml de n-hexano al primer tubo y agitar, luego centrifugar igual que arriba. Tomar la fase superior y añadir a la que ya se ha recuperado.
B.20.5.1.1.2 Productos líquidos
Pesar 5 g de producto homogéneo en un tubo de centrífuga de vidrio provisto de un esmerilado. Añadir 10 ml de dimetilsulfóxido y mezclar bien. Añadir 5 ml de solución de pirogalol y agitar. Luego añadir 10 ml de n-hexano y agitar el tubo vigorosamente durante 5 min mediante una mesa vibrante. Centrifugar el tubo, a fin de separar las dos fases líquidas.
Transferir la fase superior a otro tubo de centrífuga.
Añadir 10 ml de n-hexano al primer tubo y agitar, luego centrifugar igual que arriba. Tomar la fase superior y añadir a la que ya se ha recuperado.
B.20.5.1.1.3 Lavado del extracto
En el tubo de centrífuga que contiene la fase orgánica, añadir 10 ml de agua destilada. Agitar vigorosamente durante 5 min mediante la mesa vibrante y centrifugar.
Mediante una pipeta Pasteur tomar lo mejor posible la fase orgánica, que debe ser límpida y transferirla a un matraz en forma de pera de vidrio de 50 ml. Añadir 2 ml de n-hexano en la superficie de la fase acuosa, tomar de nuevo la fase orgánica e introducir en el matraz.
B.20.5.1.2 Extracción mediante la columna de tierra de infusorios.
B.20.5.1.2.1 Productos sólidos
En un matraz aforado de 100 ml de vidrio, pesar 2 g de producto. Añadir 0,200 g de papaína, luego 25 ml de agua a 45 °C. Mezclar bien, utilizar un baño ultrasónico si es necesario para deshacer los grumos. Incubar
durante 30 min en la estufa a 40 °C. Añadir 10 ml de dimetilsulfóxido y agitar el matraz durante 5 min mediante una mesa vibrante. Enfriar el matraz si es necesario y añadir 40 ml de tetrahidrofurano. Agitar el matraz vigorosamente durante 10 min. Llevar a volumen con agua y mezclar bien.
B.20.5.1.2.2 Productos líquidos
En un matraz aforado de 10 ml de vidrio, pesar 10 g de producto. Añadir 0,200 g de papaína y mezclar bien. Incubar durante 30 min en la estufa a 40 °C. A continuación añadir 20 ml de agua y 10 ml de dimetilsulfóxido y agitar el matraz durante 5 min mediante una mesa vibrante. Enfriar el matraz si es necesario y añadir 40 ml de tetrahidrofurano. Agitar el matraz vigorosamente durante 10 min. Llevar a volumen con agua y mezclar bien.
B.20.5.1.2.3 Preparación de la columna de extracción
Colocar el filtro circular de 10 mm en el portafiltro inferior e introducir éste en el cuerpo de la columna. Rellenar la columna con el contenido de un sobre y agitar de 10 a 20 seg mediante un vibrador de reactivos.
Presionar el filtro circular de 24 mm en el anillo con borde reforzado del recambio y deslizar éste dentro del cuerpo de la columna hasta que el filtro se encuentre sobre la superficie del relleno.
Fijar una aguja a la conexión Luer, situada en el extremo inferior de la columna; sujetar ésta mediante una pinza.
B.20.5.1.2.4 Llenado de la columna y elución
Mediante una pipeta aforada transferir 20 ml del contenido del matraz aforado (B.20.5.1.2.1 o B.20.5.1.2.2) a la columna de extracción B.20.5.1.2.3. Evitar arrastrar sedimento durante esta operación. Al cabo de 15 min eluir lentamente con 100 ml de n-hexano. La fase acuosa debe permanecer absorbida en la columna. Recoger el eluato en un matraz en forma de pera de 250 ml de vidrio. Interrumpir la operación a más tardar 30 min después que todo el n-hexano haya penetrado en la columna.
B.20.5.2 Evaporación del extracto y preparación del extracto final de la toma de ensayo.
Evaporar la solución (B.20.5.1.1.3 o B.20.5.1.2.4) bajo presión reducida y eliminar las últimas trazas de disolvente mediante una ligera corriente de nitrógeno. Recuperar el residuo cuantitativamente con la fase móvil y transferir a un matraz aforado de 5 ml para la extracción en tubos de centrífuga o de 2 ml para la extracción en columnas. Filtrar sobre una membrana antes de inyectar en la columna HPLC.
B.20.5.3 Cromatografía preparativa
Mantener el sistema HPLC preparativo con las características siguientes:
| Columna: | Lichrosorb-Si 60, 5 µm, 8 x 120 mm, o equivalente. |
| Loop: | 500 µl |
| Fase móvil: | ver punto 23.4.2 |
| Caudal: | 3 ml/min |
| Detector: | Espectrofotómetro 254 nm, 0,05 AUFS |
| Registrador: | 10 mm/min |
Inyectar primero 0,500 ml de solución patrón 4 y determinar el tiempo de retención aproximado debe ser de 5 a 7 min. A continuación inyectar 0,500 ml de solución de extracto y recoger la fracción que contiene la vitamina K1 en un matraz en forma de pera de 10 ml de vidrio, comenzando unos 30 seg antes de que se eluya la vitamina K1; interrumpir la operación unos 30 seg después de que haya sido eluida la vitamina K1.
B.20.5.4 Limpieza de la columna preparativa
A fin de eliminar rápidamente todas las impurezas retenidas por la columna durante la cromatografía preparativa, aumentar la polaridad de la fase móvil utilizando una mezcla al 10% de acetato de etilo en isooctano (B.20.4.3). Esta operación dura aproximadamente de 10 a 15 min.
Volver a introducir la fase móvil (B.20.4.2) y eluir hasta obtener una línea de base estable (aproximadamente 10 min). La columna está lista para otra inyección preparativa.
B.20.5.5 Cromatografía analítica
Evaporar a sequedad bajo una ligera corriente de nitrógeno la fracción recogida bajo (B.20.5.3). Recuperar el residuo con 250 µl de fase móvil (B.20.4.4); agitar suavemente para disolver bien el residuo.
Montar el sistema HPLC analítico con las características siguientes:
| Columna: | Spherisorb ODS, 5 µm, 4,6 x 250 mm, o equivalente. |
| Loop: | 100 µl |
| Fase móvil: | ver punto 23.4.4 |
| Caudal: | 2 ml/min |
| Detector: | espectofotómetro 248 nm, 0,01 AUFS |
| Registrador: | 10 mm/min |
Inyectar primero 0,100 ml de solución patrón 5 y determinar el tiempo de retención aproximado: debe ser aproximadamente de 5 min. A continuación inyectar 0,100 ml de la fracción obtenida más arriba.
Medir la altura de los picos correspondientes a la vitamina K1 en el patrón así como en el extracto.
Nota: El grado de silanización de la columna en fase inversa puede variar. Si es necesario, ajustar el porcentaje de diclorometano contenido en la fase móvil B.20.4.4 a fin de obtener un tiempo de retención de unos 5 min. Si el tiempo de retención es demasiado largo o demasiado corto, aumentar o disminuir respectivamente la cantidad de diclorometano.
B.20.6 Cálculo y expresión de resultados.
El contenido de vitamina K1 (fitomenadiona), en µg/100 g de producto, es igual a:
Productos líquidos, con tratamiento de extracción en tubos de centrífuga:
Productos sólidos, con tratamiento de extracción en tubos de centrífuga; productos sólidos y líquidos con tratamiento de extracción en columnas:
En donde:
h2 = altura del pico del extracto, en mm
C = concentración de la solución patrón, en µg/ml (en general 0,4 µg/ml)
V0 = volumen de extracto obtenido bajo B.20.5.2 (en general 5 ó 2 ml)
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en general 0,250 ml)
V = volumen en el cual ha sido disuelta la toma de ensayo, en ml (en general 100 ml)
h1 = altura del pico del patrón, en mm
V3 = parte alícuota de V vertida en la columna de extracción en ml (en general 20 ml), o parte alícuota de V introducida en el tubo de extracción, en ml (para productos sólidos, en general 5 ml)
V1 = volumen del extracto (V0) inyectado en la columna preparativa (en general 0,500 ml)
m = masa de la toma de ensayo, en g
B.20.7 Sensibilidad del método
El límite de detección es de aproximadamente 3 µg/100 g de producto; así pues, es posible medir con precisión aceptable contenidos de vitamina K1 a partir de una concentración de 5 µg/100 g.
B.20.8 Repetibilidad
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las mismas condiciones en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de la media de los resultados.
B.21 DETERMINACION DE BIOTINA (VITAMINA H) POR METODO MICROBIOLOGICO
B.21.1 Fundamento
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de biotina utilizando Lactobacillus plantarum ATCC 8014, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración de biotina presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio libre de biotina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación en la curva se determina la concentración de la muestra.
B.21.2 Reactivos y materiales
B.21.2.1 Reactivos
D (+) - Biotina para fines bioquímicos
Acido sulfúrico 95-97% para análisis
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis
Cristales de cloruro de sodio para análisis
Alcohol etílico absoluto
B.21.2.2 Material
Micropipeta
Material común de laboratorio
B.21.3 Aparatos e instrumentos
Centrífuga
Autoclave
Incubadora a 35 ± 1 °C
Espectrofotómetro
B.21.4 Cepa y medios de cultivo
Lactobacillus plantarum ATCC 8014
Leche descremada en polvo grado reactivo
Caldo micro inoculum
Agar bacteriológico
Caldo Bacto Lactobacilli MRS (MRS-agar)
Medio de prueba para biotina
B.21.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar)
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según las indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición vertical.
Conservar en el refrigerador 2 a 8 °C.
B.21.4.2 Mantenimiento de la cepa
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el medio (B.21.4.1) cada cuatro semanas, efectuar un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido B.21.4.3. Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 18 a 24 h a 35 °C.
B.21.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo
Caldo Micro Inoculum
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.21.5 Preparación de soluciones
B.21.5.1. Solución fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121 °C.
Conservar en el refrigerador de 2 a 8 °C.
B.21.5.2 Solución de ácido sulfúrico aproximadamente 3 N
Disolver 85 ml de ácido sulfúrico 95 - 97% a 1000 ml con agua destilada. Para ello verter al ácido con PRECAUCION en el matraz aforado que ya contiene agua. Enfriar el matraz durante la operación. Llevar a volumen.
B.21.5.3 Solución de Hidróxido de sodio, 60 g/100 ml
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo el agua del grifo. Completar a 500 ml en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de goma.
B.21.5.4 Solución de Hidróxido de sodio aproximadamente 1 N
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml con tapón de polietileno.
B.21.5.5 Solución patrón
Pesar exactamente 50,0 mg de biotina; disolver en una mezcla 1:1 agua destilada/alcohol etílico y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml. Conservar esta solución en un frasco actínico a 4 °C durante máximo 6 meses.
B.21.6 Procedimiento
B.21.6.1 Desarrollo del microorganismo
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 18 a 24 h a 35 °C.
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 6 h a 35 °C.
B.21.6.2 Preparación de la toma de ensayo
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesar de 1 a 2 g de muestra homogénea, que contenga
aproximadamente 1 µg de vitamina, añadir 50 ml de ácido sulfúrico 3 N y dispersar bien el producto. A fin de evitar la formación de grumos, añadir el ácido en pequeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el grifo de agua caliente después de cada adición.
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 1 h a 120 °C. Enfriar.
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero aproximadamente 3 ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml mientras se enfría el matraz Erlenmeyer, y luego hidróxido de sodio 1 N. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 250 o 300 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,2 ng de vitamina por ml.
B.21.6.3 Solución patrón, 0,2 ng/ml
Justo antes del uso diluir la solución (B.21.5.5) como sigue:
| 2 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml |
B.21.6.4 Medio de cultivo para el ensayo
Medio de prueba para biotina
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de material actínico de 1000 ml. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
| patrón: | 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml |
| cada producto: | 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml |
| + 50 a 100 ml de exceso |
B.21.6.5 Preparación del ensayo
B.21.6.5.1 Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:
| Tubo No.: bl | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Solución patrón: 0,0 | 0,0 | 0,25 | 0,50 | 0,75 | 1,0 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3,0 ml |
| Agua: 5 | 5 | 4,75 | 4,5 | 4,25 | 4,0 | 3,5 | 3,5 | |
